鄒曾碩，劉國(guó)鳳，唐 偉，段宏偉

(四川省涼山州馬鈴薯良種繁育推廣中心，四川 西昌 615013)

馬鈴薯脫毒試管苗在生產(chǎn)上的應(yīng)用，解決了馬鈴薯病毒病危害造成減產(chǎn)的主要問(wèn)題[1]。但是微生物（真細(xì)菌）污染一直是困擾馬鈴薯脫毒試管苗生產(chǎn)的大問(wèn)題，個(gè)別月份（夏秋季節(jié)）污染率甚至高達(dá)40%。污染直接影響到生產(chǎn)效率、生產(chǎn)成本，甚至打亂生產(chǎn)計(jì)劃。污染與培養(yǎng)環(huán)境的潔凈度直接相關(guān)，而培養(yǎng)室空氣流通少、濕度大，易導(dǎo)致各種菌類(lèi)滋生，空間潔凈度差。傳統(tǒng)的滅菌方法是使用紫外燈照射、甲醛熏蒸、過(guò)氧乙酸等，這些方法都有一定的消毒滅菌效果，但均有一定缺陷。紫外線(xiàn)對(duì)組培材料和人體有害；甲醛消毒效果較好，但殘存時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)組培材料和人體也有害，甲醛原漿毒物質(zhì)能與蛋白質(zhì)結(jié)合，吸入高濃度甲醛后，人體會(huì)出現(xiàn)呼吸道的嚴(yán)重刺激和水腫、眼刺痛、頭痛。皮膚直接接觸甲醛,可引起皮炎、色斑、壞死，經(jīng)常接觸少量甲醛，能引起慢性中毒，出現(xiàn)黏膜充血、皮膚刺激癥、過(guò)敏性皮炎等，甲醛還是基因毒性物質(zhì)，可導(dǎo)致基因突變，實(shí)驗(yàn)室證實(shí)可致癌；過(guò)氧乙酸降塵除菌，容易引起培養(yǎng)室濕度升高且刺激味強(qiáng)[2-6]。

采用新型中藥材滅菌劑蒼術(shù)和艾葉，通過(guò)與甲醛熏蒸效果作比較，克服組培生產(chǎn)傳統(tǒng)消毒方法的缺點(diǎn)，以期能實(shí)現(xiàn)馬鈴薯試管苗工廠化大規(guī)模生產(chǎn)的安全、高效、無(wú)毒害副作用、降低污染率、降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益的目的，并探求蒼術(shù)、艾葉熏蒸在馬鈴薯脫毒試管苗組培生產(chǎn)上是否適用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為中藥鋪采購(gòu)的蒼術(shù)成品塊莖和干燥艾葉，甲醛，高錳酸鉀，馬鈴薯脫毒試管苗繼代培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2009年于涼山州馬鈴薯良種繁育推廣中心組培室完成該試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置9處采樣點(diǎn)，分別為靠近組培室邊緣的8個(gè)點(diǎn)（平均分布）和中央的1個(gè)點(diǎn)，熏蒸選取組培室平均分布的3個(gè)點(diǎn)。蒼術(shù)、艾葉和甲醛熏蒸分別選取兩間組培室同時(shí)進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熏蒸滅菌

（1）蒼術(shù)、艾葉熏蒸選取一間組培室（體積56 m3），用量為2.0 g·m-3。艾葉經(jīng)干燥后直接點(diǎn)燃，蒼術(shù)先用95%酒精浸泡24 h，熏蒸時(shí)以酒精為助燃劑點(diǎn)燃。在培養(yǎng)室按3～5個(gè)點(diǎn)均勻分布，點(diǎn)燃后密閉培養(yǎng)室熏蒸1 h。

表1 蒼術(shù)在組培室的熏蒸效果Table1 Fumigation effects of atractylodes in potato tissue culture laboratory

（2）甲醛熏蒸選取大小一致的組培室，用量為甲醛2 mL·m-3加高錳酸鉀1 g·m-3，將甲醛溶液倒入盛裝高錳酸鉀的容器后立即撤離，并關(guān)閉門(mén)窗。

1.3.2 菌落檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)

采用自然沉降法測(cè)定菌落數(shù)量：打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋暴露10 min，分別在熏蒸前和熏蒸后3～4 d各采樣1次，在室溫下培養(yǎng)2 d，然后按霉菌、細(xì)菌進(jìn)行菌落數(shù)分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。

采樣方法：分別在組培室的四周（距墻50 cm左右）及中間1～2個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)奧氏公式計(jì)算培養(yǎng)室空氣含菌數(shù)(cfu·m-3)，再計(jì)算出消毒滅菌率，分析其滅菌效果。

空氣菌落總數(shù)（cfu·m-3）=50000 N/A×T

公式中A為培養(yǎng)皿面積(cm2)，T為培養(yǎng)皿暴露時(shí)間（min），N 為培養(yǎng)皿平均菌落數(shù)（cfu·皿-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒼術(shù)的熏蒸效果

從表1統(tǒng)計(jì)可以看出，蒼術(shù)熏蒸后馬鈴薯組培室空氣細(xì)菌含量與熏蒸前差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），從蒼術(shù)對(duì)真細(xì)菌的滅菌率差異來(lái)看，對(duì)細(xì)菌的滅菌率明顯高于對(duì)真菌的滅菌率。

2.2 艾葉的熏蒸效果

從表2統(tǒng)計(jì)分析可以看出，艾葉熏蒸后馬鈴薯組培室空氣真菌含量與熏蒸前差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），從艾葉對(duì)真細(xì)菌的滅菌率差異來(lái)看，對(duì)真菌的滅菌率明顯高于對(duì)細(xì)菌的滅菌率。

2.3 甲醛的熏蒸效果

從表3統(tǒng)計(jì)分析可以看出，甲醛對(duì)真細(xì)菌滅菌效果基本一致，且熏蒸前后組培室空氣含菌量差異顯著（P＜0.05），這證實(shí)了甲醛在空氣消毒上的實(shí)際效果。

表1～3顯示，組培室的各個(gè)空間位置的含菌量各不相同，處于靠墻的角落含菌量最高，其他邊緣次之，中央的含菌量最低。且蒼術(shù)、艾葉在熏蒸后有濃郁的中藥氣味，而且殘留時(shí)間較長(zhǎng)，可對(duì)環(huán)境進(jìn)行穩(wěn)定控制，雖有中藥氣味，但不會(huì)對(duì)人體造成傷害，較其它熏蒸藥劑（甲醛）安全可靠。通過(guò)對(duì)熏蒸后組培室馬鈴薯試管苗的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，此中藥材熏蒸對(duì)試管苗生長(zhǎng)無(wú)影響，不會(huì)對(duì)其造成不良反應(yīng)。

表2 艾葉在組培室的熏蒸效果Table2 Fumigation effects of argy wormwood leaf in potato tissue culture laboratory

表3 甲醛在組培室的熏蒸效果Table3 Fumigation effects of formaldehyde in potato tissue culture laboratory

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，蒼術(shù)、艾葉適用于馬鈴薯組培室的消毒滅菌，而且中藥氣味殘留時(shí)間較長(zhǎng)，可對(duì)環(huán)境進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的控制，雖有中藥氣味，但屬安全無(wú)毒氣體，不會(huì)對(duì)人體造成傷害，較甲醛安全可靠。甲醛已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為一類(lèi)致癌物，并且認(rèn)為甲醛與白血病發(fā)生之間存在著因果關(guān)系，熏蒸后具有強(qiáng)烈的刺激味道，殘留時(shí)間長(zhǎng)，影響了生產(chǎn)進(jìn)度。植物組培室滅菌不僅要考慮對(duì)人體的安全影響，同時(shí)也要考慮是否對(duì)植物試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育造成不良影響，只有對(duì)人體和試管苗均無(wú)損害的熏蒸制劑才可用。通過(guò)對(duì)熏蒸后組培室馬鈴薯試管苗的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行持續(xù)觀察，此中藥材熏蒸對(duì)試管苗生長(zhǎng)無(wú)影響，不會(huì)對(duì)其造成不良反應(yīng)。

蒼術(shù)、艾葉分別對(duì)真菌和細(xì)菌有特效，蒼術(shù)對(duì)細(xì)菌的滅菌效果優(yōu)于真菌，而艾葉對(duì)真菌的滅菌效果優(yōu)于細(xì)菌，所以在使用過(guò)程中可以針對(duì)污染情況的不同采取不同熏蒸方式，既避免材料的浪費(fèi)又達(dá)到滅菌效果，這將對(duì)馬鈴薯試管苗組培室真、細(xì)菌污染做出針對(duì)性滅菌提供依據(jù)。從蒼術(shù)、艾葉與甲醛的熏蒸效果比較，此新型中草藥熏蒸制劑適用于馬鈴薯組培室的消毒滅菌，克服了傳統(tǒng)消毒方法缺點(diǎn)，安全、高效、無(wú)毒害副作用、降低污染率，在馬鈴薯脫毒試管苗工廠化大規(guī)模生產(chǎn)中，降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。

在真細(xì)菌數(shù)量記錄中發(fā)現(xiàn)組培室的細(xì)菌含量比真菌含量要低，這與前人研究結(jié)果有所不同[7]，原因是在平時(shí)生產(chǎn)過(guò)程中我們著重于防治細(xì)菌污染，所以組培室的細(xì)菌含量相對(duì)較低。

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