周 斌，杜俊成

（湖北省襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 襄樊 441050）

2009年4月初，襄樊附近某家養(yǎng)殖場(chǎng)的蛋雞發(fā)病，并有死亡。通過(guò)臨床癥狀和病理解剖初診為大腸桿菌病。從現(xiàn)場(chǎng)采集病死雞，經(jīng)解剖無(wú)菌采集病料，通過(guò)病原分離和生化培養(yǎng)等試驗(yàn)，最終確定病原體為禽致病性大腸桿菌，分離的大腸桿菌用臨床常用的抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇藥物，有效控制了該雞場(chǎng)的病情。

1 材料

1.1 病料來(lái)源 無(wú)菌采集養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞的肝臟、心臟、脾、十二指腸等樣本。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 血液培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基，細(xì)菌生化鑒定管，腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管（杭州微生物試劑有限公司）；試劑：細(xì)菌生化微量試驗(yàn)試劑盒（杭州微生物試劑有限公司），革蘭氏染液（自配），以及解剖器械等。

1.3 藥敏紙片 用常用的氧氟沙星、氨卞西林、乙酰甲喹、慶大霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、阿莫仙、頭孢噻肟鈉、頭孢塞呋、鏈霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、替米考星、粘菌素、諾美沙星、恩諾沙星、泰樂(lè)菌素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 主要試驗(yàn)設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、無(wú)菌工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、pH紙、電爐、冰箱。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 健康的小白鼠。

2 方法

2.1 動(dòng)物解剖 從發(fā)病場(chǎng)采集病雞和病死雞進(jìn)行解剖，先觀察活雞的外部癥狀，其表現(xiàn)為精神沉郁、呆立、昏睡閉眼、共濟(jì)失調(diào)、下痢。剖檢可見(jiàn)心外膜、冠狀脂肪出血，蛋雞卵子有大量的血斑、出血、水腫。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病死雞的肝臟、心臟、脾、十二指腸等樣本，分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h。

2.3 純培養(yǎng) 挑取麥康凱培養(yǎng)基上粉紅色的單個(gè)菌落在麥康凱培養(yǎng)基上劃線純培養(yǎng)，再將純培養(yǎng)物接種到普通培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，取出置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細(xì)菌染色鏡檢 用滅菌接種環(huán)挑取麥康凱培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

2.5 生化試驗(yàn) 挑取上述麥康凱培養(yǎng)基或血液培養(yǎng)基的菌落接種到大腸桿菌培養(yǎng)基上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24h，觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的基本特征。參照生化鑒定的使用說(shuō)明書(shū)，挑取麥康凱培養(yǎng)基或血液培養(yǎng)基的單個(gè)菌落接種到腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管內(nèi)，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，按規(guī)定時(shí)間對(duì)菌株的生化結(jié)果進(jìn)行判斷。

2.6 藥敏試驗(yàn) 用2.5～3mL的生理鹽水注入純培養(yǎng)培養(yǎng)基里將細(xì)菌洗涂均勻后，均勻涂布在整個(gè)普通培養(yǎng)基上，待普通培養(yǎng)基上的菌液稍干后，將藥片依次均勻貼放到平板上，藥片與藥片之間相距1～2 cm，藥片距平板邊緣1 cm，將平皿倒置37℃培養(yǎng)16～18h后觀察結(jié)果，并測(cè)量抑菌圈的直徑。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性 病料在血液培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成一種圓形凸突，光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，半透明，呈中等大小的灰白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上形成直徑為1～2mm左右，光滑濕潤(rùn)的紅色菌落。

3.2 染色鏡檢結(jié)果 為革蘭氏陰性小桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)存在。

3.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。分離菌株的生化特性完全符合大腸桿菌的特性。綜合解剖癥狀、培養(yǎng)特征、鏡檢特征、生化試驗(yàn)結(jié)果，可鑒定此分離菌株為致病性大腸桿菌。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.4 藥敏結(jié)果 見(jiàn)表2

3.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 給小白鼠注射此細(xì)菌24～48h內(nèi)全部死亡，剖檢死亡小白鼠，發(fā)現(xiàn)其肝臟腫脹出血，心外膜出血，對(duì)死亡小白鼠的肝臟、心臟等病料進(jìn)行涂片鏡檢，所觀察到的菌株與原分離細(xì)菌一致，說(shuō)明此菌株為致病性大腸桿菌。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)與討論

4.1 根據(jù)解剖癥狀、培養(yǎng)特征、鏡檢特征、生化試驗(yàn)結(jié)果，可判斷此分離菌株為致病性大腸桿菌。雞的大腸桿菌是由大腸桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱。本病一年四季均可發(fā)生，各個(gè)品種、日齡都可發(fā)病，但雉雞最易感染，發(fā)病率可達(dá)30%～60%，死亡率可達(dá)100%。

4.2 大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，由于近年來(lái)抗菌藥使用頻繁，不合理使用及加大量使用，甚至濫用，使得臨床耐藥菌株不斷增加。由于不同地區(qū)的致病性大腸桿菌可能不同，若要控制當(dāng)?shù)夭∏?，減少損失，就應(yīng)及時(shí)分離出病原并進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，選出敏感藥物進(jìn)行防治。

通過(guò)對(duì)襄樊某養(yǎng)殖場(chǎng)臨床分離的致病性大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，得出該致病性大腸桿菌菌株對(duì)氧氟沙星、丁胺卡那、恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素、粘菌素高度敏感，對(duì)乙酰甲喹、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿莫仙、頭孢塞呋有較強(qiáng)的耐藥，對(duì)泰樂(lè)菌素、頭孢噻肟鈉、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、替米考星、氨卞西林耐藥。這些結(jié)果與何敏等報(bào)道的河南地區(qū)致病性大腸桿菌的耐藥性差異較大，其結(jié)果是對(duì)頭孢噻呋、粘菌素仍較敏感，這可能與不同地區(qū)的飼養(yǎng)管理、藥物的經(jīng)驗(yàn)性使用及飼養(yǎng)環(huán)境不同有關(guān)。

根據(jù)藥敏結(jié)果選擇高敏感藥物氟苯尼考的可溶性粉劑對(duì)全場(chǎng)雞混飲（100mg/L），每天2次，每次飲水2 h，連用1周；同時(shí)加強(qiáng)雞舍環(huán)境衛(wèi)生消毒，加強(qiáng)溫度、濕度、通風(fēng)管理等，有效地控制了雞只死亡，漸漸使雞場(chǎng)整個(gè)病情有所好轉(zhuǎn)。

[1]WS/T125-1999.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[S].中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2000.

[2]韓文俞.病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)[M].長(zhǎng)春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[3]何 敏.河南信陽(yáng)雞場(chǎng)大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J].中國(guó)家禽，2010.