張世權(quán) 肖德明 關(guān)弘 李偉 譚紀(jì)鋒 朱玉華

大劑量新輔助化療的開展使骨肉瘤的治療取得了突破性進(jìn)展。近10余年來，骨肉瘤的治療似乎進(jìn)入了一個平臺期，其生存率難以進(jìn)一步提高，原因之一可能與多藥耐藥基因(MDR)有關(guān)。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測MDR產(chǎn)物P糖蛋白(p-gp)在36例骨肉瘤組織的表達(dá)，旨在探討骨肉瘤p-gp表達(dá)與骨肉瘤臨床預(yù)后的的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 36例骨肉瘤標(biāo)本均為我院活檢或手術(shù)切除后經(jīng)石蠟包埋存檔的組織并經(jīng)病理學(xué)確診，其中男19例，女17例，年齡平均19.9歲。Enneking分期ⅡA3例，ⅡB27例，ⅢB6例，并發(fā)病理性骨折7例。所有病例手術(shù)時均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，取材前均未接受過放療和細(xì)胞毒性藥物治療。17例骨軟骨瘤均為少數(shù)切除后經(jīng)石蠟包埋存檔的組織并經(jīng)病理學(xué)確診。隨訪結(jié)果：36例骨肉瘤隨訪時間平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移全身衰竭致死。

1.2 p-gp檢測方法 選擇含腫瘤細(xì)胞豐富切片之對應(yīng)的石蠟包埋標(biāo)本，常規(guī)經(jīng)5μm厚連續(xù)切片，行鏈菌素親生物素-過氧化物酶法(S-P法)免疫組化染色，所有試劑均購自福州邁新公司,技術(shù)操作按規(guī)定程序進(jìn)行。以PBS液代替一抗作為空白對照。

1.3 結(jié)果判定與統(tǒng)計學(xué)處理 油鏡(×100)下觀察p-gp染色分布于細(xì)胞膜和漿中，呈棕褐色顆粒狀，并為片狀或灶狀分布。每張切片觀察10個高倍鏡視野，取其平均數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)小于5%為陰性，大于5%為陽性。每份標(biāo)本同時作 HE染色，行常規(guī)病理學(xué)檢查。統(tǒng)計學(xué)處理：不同組間p-gp表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理采用x2檢驗。

2 結(jié)果

36例骨肉瘤隨訪時間平均3.5a，其中存活3a及以上者13例，存活3a以下者23例，死亡病例均因骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移全身衰竭致死。36例骨肉瘤p-gp陽性表達(dá)率為50.0%，顯著高于骨軟骨瘤組，有顯著性差異(P＜0.01)。p-gp表達(dá)在不同Enneking外科分期組間無顯著性差異(P＞0.05)，在生存時間3a及以上組及3a以下組間有顯著性差異(P＜0.01)。見表1～3。

3 討論

P糖蛋白(p-gp)是多藥耐藥基因(MDR)編碼的蛋白質(zhì)，它在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、大腸癌及肝癌中均有較高表達(dá)。目前有關(guān)骨肉瘤細(xì)胞MDR基因p-gp表達(dá)的研究尚不多，但已有證據(jù)表明骨肉瘤常表現(xiàn)出p-gp高表達(dá)[1]。Stein等[2]用PCR技術(shù)證實9例骨肉瘤中的7例有MDR基因的異常。Wunder等[3]的研究發(fā)現(xiàn)15例骨肉瘤患者的18個標(biāo)本均有不同程度的MDR表達(dá)。Kandel[4]應(yīng)用免疫組化技術(shù)的研究表明10例骨肉瘤中有50%為p-gp表達(dá)陽性。本組應(yīng)用免疫組化的方法，對MDR基因所編碼的p-gp在骨肉瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在36例中，18例為陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為50.0%，顯著高于作為對照的骨軟骨瘤組，有顯著性差異(P＜0.01)，提示p-gp表達(dá)可能與骨肉瘤作為高度惡性腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。關(guān)于P糖蛋白表達(dá)對骨肉瘤預(yù)后影響的研究，目前結(jié)論尚不一致。Wunder[3]在對一組骨肉瘤患者30個月的隨訪結(jié)果中發(fā)現(xiàn)MDR高水平表達(dá)的患者預(yù)后較差。Peabody等[5]在評價影響骨肉瘤患者預(yù)后因素時提出多藥耐藥基因及其產(chǎn)物p-gp的表達(dá)是一重要因素。郭偉[6]在對67例惡性骨腫瘤的(其中骨肉瘤20例)p-gp表達(dá)的免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)：盡管p-gp陽性組的2a及5a生存率較陰性組低，但無顯著性差異。沈靖南[7]采用免疫組化LSAB法，檢測84例骨肉瘤中p-gp表達(dá)，半定量化計量p-gp的著色強度及陽性率，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤p-gp表達(dá)的陽性率為55.1%，p-gp陽性表達(dá)中的65.2%為低表達(dá)，認(rèn)為骨肉瘤組織分主流細(xì)胞群和稀有細(xì)胞群，它們表達(dá)p-gp有不同的預(yù)后價值：主流細(xì)胞群表達(dá)p-gp，體現(xiàn)于p-gp的表達(dá)量和范圍，早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良；稀有細(xì)胞群表達(dá)p-gp的臨床意義取決于著色強度。高水平表達(dá)，肺轉(zhuǎn)移早，預(yù)后不良，而低水平表達(dá)，肺轉(zhuǎn)移遲，預(yù)后好于前者。Serra等[8]用半定量免疫熒光法檢測105例骨肉瘤，其中38例經(jīng)隨訪2a發(fā)現(xiàn)：p-gp過度表達(dá)與高轉(zhuǎn)移率、預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果顯示p-gp蛋白表達(dá)在不同Enneking外科分期組間無顯著性差異(P＞0.05)，在生存時間3a及以上組及3a以下組間有顯著性差異(P＜0.01)，生存3a以下的患者其p-gp表達(dá)陽性率明顯高于3a及以上的患者，表明p-gp表達(dá)對骨肉瘤患者的預(yù)后評估具有一定價值，p-gp陽性表達(dá)的骨肉瘤患者預(yù)后較差。當(dāng)然，影響骨肉瘤預(yù)后的因素十分復(fù)雜，已有的證據(jù)證明與病理分型、外科分期、腫瘤大小、起病緩急、有無病理性骨折、堿性磷酸酶水平以及是否進(jìn)行規(guī)范大劑量化療等多種因素有關(guān)。有關(guān)P53蛋白表達(dá)在骨肉瘤預(yù)后評估中的作用，有必要進(jìn)一步進(jìn)行大樣本研究和統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 骨肉瘤與骨軟骨瘤的p-gp表達(dá)(例)

表2 骨肉瘤不同Enneking分期的p-gp表達(dá)(例)

表3 骨肉瘤不同預(yù)后的p-gp表達(dá)(例)

[1]應(yīng)明.骨肉瘤多藥耐藥性及其逆轉(zhuǎn)[J].中華骨科雜志,1997,17(7)：461-463.

[2]Stein U,Walther W,Wanderlich V.Point mutations in the mdrl promoter of human osteosarcomas are associated with in vitro resposiveness to multidrug resistance relevant drugs[J].Eur J Cancer(Am),1994,30：1541-1548.

[3]Wunder JS,Bell RS,Wold L,et al.Expression of the multidrug resistance gene in osteosarcoma：a piolt study[J].J Orthop Res,1992,11：396-402.

[4]Kandel RA,Campbell S,Noble TS,et al.Correlation of P-glycoprotein detection by immunohistochemistry with mdrl mRNA level in osteosarcoma：piolt study[J].Diagn Mol Pathol,1995,4：59-65.

[5]Peabody TD,GibbS CP,Simon MA.Evalution and staging of musculoskeletal neoplasms[J].J Bone Joint Surg,1998,80(A)：1204-1218.

[6]郭偉,肖穎,盛傳家,等.P170和PCNA在惡性骨腫瘤中的表達(dá)[J].中華骨科雜志,1998,18：423-425.

[7]沈靖南,王晉,韓士英,等.骨肉瘤p-糖蛋白表達(dá)水平與肺轉(zhuǎn)移[J].中華骨科雜志,2000,20：21-24.

[8]Serra M,Scotlandi K,Manara MC,et al.Analysis of P-glycoprotein expression in osteosarcoma[J].Eur J Cancer (Am),1995,31：1998-2002.