李 靜 諸 穎 張小勇 李文新 黃 慶

1 (中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)

2 (中國科學(xué)院研究生院 北京 100049)

碳納米材料已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域中的納米科技研究，構(gòu)建納米藥物輸運系統(tǒng)是碳納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一個重要研究方向。碳納米管以及修飾有各種化學(xué)分子的碳納米管復(fù)合物，能有效地被細(xì)胞攝取[1?3]。另一方面，碳納米管表面特殊的結(jié)構(gòu)，使許多化學(xué)分子或生物大分子能以共價或非共價方式連接在碳納米管上，組成碳納米管復(fù)合物。因此，碳納米管能成為一種有效的細(xì)胞內(nèi)藥物輸運載體，一些很難穿越細(xì)胞膜的小分子藥物(多肽、蛋白質(zhì)藥物或 DNA)，可借助碳納米管有效進(jìn)入細(xì)胞，從而增強(qiáng)它們的藥效[4?6]。除載帶的藥物外，碳納米管的外壁還能修飾一些功能化基團(tuán)，如熒光素、靶向基團(tuán)等。以碳納米管為平臺構(gòu)建的納米藥物輸運系統(tǒng)，能同時發(fā)揮多種功能，即藥物的靶向、細(xì)胞內(nèi)輸入的高效、可控或緩釋、在生命體系中可視化檢測與研究等，達(dá)到降低用藥量、增強(qiáng)藥效、減少藥物毒副作用等目的[7?9]，這是新一代復(fù)合藥物研制的重要發(fā)展方向。

近年來，納米金剛石(NDs)作為藥物載體的研究已引起關(guān)注。NDs具有化學(xué)惰性，研究結(jié)果表明，NDs對細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性，顯示出良好的生物相容性[10?12]。研究發(fā)現(xiàn)，無機(jī)分子 NaCl和 NaOH能促進(jìn)藥物在NDs上的藥物負(fù)載量[13?16]。因此，水溶性差的藥物分子能被NDs有效載帶，并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)而高效行使其生物效應(yīng)。目前已有就多種癌癥的化療劑和糖尿病治療藥物，進(jìn)行了 NDs載帶研究，每次僅載帶一種藥物分子。NDs可否成為像碳納米管那樣的同時載帶若干不同功能分子的多功能藥物輸運系統(tǒng)，此類研究尚未見報道。本文嘗試了抗癌藥物 10-羥基喜樹堿(HCPT)、異硫氰酸熒光素(FITC)和腫瘤細(xì)胞靶向分子轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)在NDs上的負(fù)載，研究了負(fù)載多種功能基團(tuán)的金剛石復(fù)合物的細(xì)胞攝取，以及復(fù)合物對腫瘤Hela細(xì)胞的毒性，目的在于探索以 NDs為平臺構(gòu)建多功能藥物靶向輸運系統(tǒng)的可能性。

1 實驗材料與方法

1.1 材料及其表征

采用爆炸法合成的 NDs(甘肅金石納米材料有限公司)，單顆粒尺寸2–10 nm，未經(jīng)處理直接用于實驗。將一定量的 NDs分散在純水溶液中，超聲30 min以徹底分散，得到分散性良好穩(wěn)定的ND儲存液。用荷蘭 Philips公司生產(chǎn)的透射電鏡(TEM，CM120)表征100 μg/mL的NDs水溶液，紅外光譜(FT-IR，Nicolet Avatar-360)表征NDs干粉。

1.2 異硫氰酸熒光素(FITC)在NDs上的吸附

將2 mg/mL的NDs水溶液與溶解于DMSO溶液的FITC(1 mg/mL)混合，超聲10 min，室溫震蕩24 h，將混合液離心，棄上清液，清洗沉淀三次，得到FITC-ND復(fù)合物，用于吸附HCPT及TF后的熒光顯微鏡(德國Zeiss公司，Axioskop2 plus)觀察實驗。

1.3 10-羥基喜樹堿(HCPT)在NDs上的吸附

將HCPT分散在純水中，并加入適量NaOH助溶，所得HCPT溶液(4 mg/mL, pH=8.2)與2 mg/mL的 NDs水懸液混合后，在 25℃條件下震蕩 3 d，13000 r/min離心1 h，吸出上清液待測。不含NDs的 HCPT溶液為對照組，紫外光譜儀(UV-spectra,Hitachi U-3010)掃描實驗組和對照組在300–500 nm范圍內(nèi)的光譜，基于實驗組與對照組在380 nm處的吸光值差異，計算HCPT在NDs上的3 d吸附量。

將制得的FITC-ND復(fù)合物分散于純水中，按上述方法吸附HCPT，制得HCPT-FITC-ND復(fù)合物備用。

1.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)在NDs上的吸附

將轉(zhuǎn)鐵蛋白以 10%的終濃度，加入 HCPT-ND及HCPT-FITC-ND復(fù)合物懸液中，并短時超聲混合。為使TF充分負(fù)載于復(fù)合物上，將混合液置于25℃環(huán)境下震蕩4 h，依上述方法離心清洗分散后，得到TF-HCPT-ND及TF-HCPT-FITC復(fù)合物。

1.5 復(fù)合物TF-HCPT-ND的細(xì)胞存活率檢測

Hela細(xì)胞以105cells/mL的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜，將HCPT-ND、TF-HCPT-ND復(fù)合物分散于細(xì)胞培養(yǎng)基，按實驗要求加入24孔板，使孔中復(fù)合物終濃度達(dá)100 μg/mL(以ND計)。對照組孔中加入 100 μg/mL NDs，或 50 μg/mL HCPT。此時，復(fù)合物組的HCPT劑量基本接近對照組。24 h培養(yǎng)，MTT法檢測Hela細(xì)胞24 h存活率。所有實驗均重復(fù)三次。

1.6 復(fù)合物FITC-HCPT-NDs孵育細(xì)胞后熒光鏡下觀察

NDs吸附FITC后，按前述方法吸附HCPT及TF，分別得到復(fù)合物HCPT-FITC-ND及TF-HCPTFITC-ND。Hela細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使其充分貼壁，將兩種復(fù)合物分別加入培養(yǎng)體系中，孵育3、8、24 h后用PBS小心沖洗細(xì)胞，盡量去除未被細(xì)胞吞噬的復(fù)合物，將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡(Zeiss，Axioskop 2)下觀察。

2 實驗結(jié)果

2.1 表征

本文所用NDs懸浮于純水中，很易超聲分散，且不易沉降。TEM表征結(jié)果顯示(圖1a)，NDs大多以團(tuán)聚的顆粒狀存在，尺寸40–200 nm。紅外光譜表征NDs的結(jié)果如圖1(b)，所得光譜峰位與文獻(xiàn)[13]納米金剛石特征峰位一致。

圖1 納米金剛石的表征 (a)透射電鏡圖像，(b)紅外光譜Fig.1 TEM image (a) and FT-IR spectra (b) of the NDs.

2.2 NDs對HCPT吸附量測定

少量的NaOH能顯著提高HCPT的水溶解度，紫外光譜顯示，加入NaOH后HCPT在380 nm處的特征峰未被改變，所以可借此提高HCPT在NDs上的吸附[16]。紫外光譜對 NDs吸附前后的 HCPT溶液進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，吸附后的HCPT溶液吸光值明顯低于未吸附溶液(圖 2)，提示了 HCPT在NDs上的吸附。測量吸附前后樣品在380 nm處的吸光值變化，計算出HCPT在NDs上的吸附量。本文將NDs與HCPT共同混合震蕩孵育3天，得到吸附量為42.5%。同樣方法得到HCPT在FITC-ND上的吸附量為41.3%，與HCPT在ND上的吸附量差別不大。

圖2 HCPT被NDs吸附前后的紫外光譜比較Fig.2 UV-Vis spectra of HCPT before and after adsorption with NDs for 72 h.

2.3 復(fù)合物細(xì)胞存活率檢測

納米顆粒能通過不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞，如吞噬作用、液相內(nèi)吞及受體介導(dǎo)的胞吞作用。因此，設(shè)置兩種復(fù)合物組(HCPT-ND、TF-HCPT-ND)以比較靶向基團(tuán)轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用。細(xì)胞 MTT存活率檢測結(jié)果表明(圖3)，NDs對細(xì)胞無毒性，比較單獨藥物組HCPT及復(fù)合物HCPT-ND、TF-HCPT-ND結(jié)果，復(fù)合物組的藥效明顯高于單獨藥物組，證明了NDs吸附HCPT后，將其有效帶入胞內(nèi)發(fā)揮藥效。各組比較，毒性最強(qiáng)的是TF-HCPT-ND，提示復(fù)合物上的TF很可能與Hela 細(xì)胞表面的TF受體結(jié)合，通過 TF受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使更多的復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組與對照組比較P<0.05；TF-HCPT-ND組與HCPT-ND組相比，存活率下降 9.03%，差異顯著(P<0.05)。

圖3 ND、HCPT、HCPT-ND、TF-HCPT-ND的24 h細(xì)胞存活率檢測Fig.3 Viability of Hela cells treated with ND, HCPT,HCPT-ND and TF- HCPT-ND for 24 h.All data were averaged from three parallel experiments.

2.4 熒光顯微鏡下觀察

FITC標(biāo)記的復(fù)合物孵育細(xì)胞后，熒光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)如圖 4所示。由圖 4，孵育 3 h后，HCPT-FITC-ND組可見細(xì)胞輪廓及較淡的熒光，說明復(fù)合物在細(xì)胞膜上有少量粘附，而TF-HCPT-FITC-ND 組的熒光強(qiáng)度明顯高于HCPT-FITC-ND組，兩種復(fù)合物孵育細(xì)胞24 h后，鏡下觀察看到約大半細(xì)胞形態(tài)變圓，胞膜不完整，證明細(xì)胞死亡，TF-HCPT-FITC-ND組死亡細(xì)胞略多于HCPT-FITC-ND組。觀察結(jié)果與細(xì)胞存活率結(jié)果相符。

圖4 復(fù)合物TF-HCPT-FITC-ND及HCPT-FITC-ND孵育細(xì)胞不同時間后的熒光顯微鏡圖像Fig.4 Fluorescence images of Hela cells incubated with TF-HCPT-FITC-ND and HCPT-FITC-ND after incubation of different time.

3 討論

細(xì)胞存活率檢測結(jié)果表明，ND無顯著細(xì)胞毒性，單獨HCPT的毒性也較小，而藥物-納米金剛石復(fù)合物的毒性高，結(jié)果與文獻(xiàn)[16]一致，證明 ND能有效吸附HCPT并將其帶入胞內(nèi)發(fā)揮藥效。另外，載有TF的復(fù)合物毒性最強(qiáng)，說明TF發(fā)揮了靶向作用。我們選用 TF作為靶向分子，是因為在多種癌細(xì)胞表面，都存在TF受體的過表達(dá)，因此，TF能被多種癌細(xì)胞特異性識別，與 TF受體結(jié)合，激活TF受體介導(dǎo)的胞吞作用[17?19]。這為復(fù)合物的細(xì)胞攝取提供了更高效的途徑。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，TF-HCPT-FITC-ND組的熒光強(qiáng)度明顯高于HCPT-FITC-ND組，說明當(dāng)TF-HCPT-ND孵育細(xì)胞3 h后，復(fù)合物上的TF已與細(xì)胞膜上的TF受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，使更多的復(fù)合物進(jìn)入到胞內(nèi)。此結(jié)果與細(xì)胞存活率結(jié)果相符。

在現(xiàn)有藥物載體研究中，碳納米管[4?9,20,21]、石墨烯[22?24]、樹狀高分子[25?28]等材料均具有特殊的結(jié)構(gòu)及豐富的化學(xué)活性(表層分布的大量的官能基團(tuán))，利用這些化學(xué)性質(zhì)可將多種藥物和其他功能基團(tuán)修飾上去，使它們成為多功能的藥物載體。納米金剛石修飾多種基團(tuán)的工作尚處于起步階段[29?32]，可能是因為納米金剛石的化學(xué)惰性，使其多功能基團(tuán)的同時修飾相當(dāng)困難，NDs的多基團(tuán)修飾需另辟蹊徑。

我們在NDs吸附多種分子的初期實驗中發(fā)現(xiàn)，其對不同大小的分子吸附行為的差異較大，如細(xì)胞全培養(yǎng)液中的蛋白類分子BSA在NDs上的吸附1 h即達(dá)平衡，而較小藥物分子HCPT至少需5天才能達(dá)到平衡。由此提出如下的NDs吸附模型：當(dāng)NDs分散于培養(yǎng)基中，形成了團(tuán)聚，這些團(tuán)聚物具有與外界相通、尺寸不一的納米通道或小孔，當(dāng)小分子藥物(如HCPT)與NDs團(tuán)聚物接觸后，慢慢進(jìn)入團(tuán)聚物內(nèi)部的孔道中，故HCPT在NDs上充分負(fù)載需較長時間，吸附量也相對較高；而BSA類的蛋白質(zhì)分子因分子大而不能進(jìn)入孔道，則更多地被吸附在團(tuán)聚物表面，故短時間內(nèi)即達(dá)平衡。

根據(jù)這種團(tuán)聚物的特殊空間構(gòu)型及對多種分子較強(qiáng)的吸附能力，我們設(shè)想，NDs有可能以不同于碳納米管、氧化石墨烯和樹狀高分子的機(jī)制來組裝復(fù)合藥物輸運系統(tǒng)。本實驗基于所提出的假設(shè)，讓較小的分子先進(jìn)入納米金剛石團(tuán)聚物內(nèi)部，大的分子吸附在外部，從小到大按層組裝藥物復(fù)合系統(tǒng)。實驗證明，此復(fù)合系統(tǒng)具有藥物活性、熒光及靶向功能，且藥效也提高了，證明了我們提出假設(shè)的合理性和可靠性。

本文基于納米金剛石的團(tuán)簇多孔特性，成功組裝具有多種功能的納米金剛石復(fù)合藥物輸運系統(tǒng)，達(dá)到預(yù)期效果，開創(chuàng)了納米金剛石藥物輸運系統(tǒng)的研制新途徑。

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