農(nóng)桿菌介導(dǎo)SAD基因轉(zhuǎn)化淺白隱球酵母的條件優(yōu)化

陳東亮，李紀(jì)元，范正琪，范妙華，田 敏

（中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400）

生物質(zhì)能源的開發(fā)利用是解決能源危機(jī)的重要途徑之一。植物油脂是生產(chǎn)生物柴油的主要原料來源，具有一定的規(guī)模，但高昂的原料成本[1]嚴(yán)重限制了該產(chǎn)業(yè)發(fā)展。利用微生物油脂為原料生產(chǎn)生物柴油的途徑不存在此問題，且具有資源豐富、油脂含量高、碳源利用廣等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

最適合做生物柴油的脂肪酸是：有較長的直碳鏈，最好有一個(gè)不飽和雙鍵存在脂肪酸[2]。植物中的Acyl-ACP脫飽和酶定位于質(zhì)體上，催化植物不飽和脂肪酸生物合成途徑中的第一步脫飽和反應(yīng)，直接調(diào)控著飽和與不飽和脂肪酸的比例?！?硬脂酰-ACP脫飽和酶（Stearoyl-ACP desaturase），簡稱：SAD，是目前研究最多、最廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化硬脂酸在第9～10碳原子之間脫氫形成第一個(gè)雙鍵，生成油酸。為提高優(yōu)良產(chǎn)油菌淺白隱球酵母（油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的65%）脂肪酸的質(zhì)量，筆者利用基因工程技術(shù)將木本油料樹種千年桐（Vernicia Montana）中的SAD基因轉(zhuǎn)入到淺白隱球酵母，期望通過調(diào)節(jié)其代謝途徑提高其油脂質(zhì)量。

與PEG-CaCl2法、醋酸鋰法、電擊法、基因槍法等傳統(tǒng)真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）具有操作簡便、遺傳穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，因此它成為了當(dāng)前發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的遺傳轉(zhuǎn)化方法之一。筆者利用ATMT法對淺白隱球酵母進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并對影響轉(zhuǎn)化結(jié)果的若干關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 SAD基因（全長1 191 bp）的真菌表達(dá)載體pCAM 2300-sad由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[5]，該質(zhì)粒攜帶CAMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPT II）；根癌農(nóng)桿菌 LBA 4404、AGL-1（均含質(zhì)粒pCAM 2300-sad）為本所實(shí)驗(yàn)室保存；高產(chǎn)油脂的淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試 劑 卡那霉素、利福平、頭孢呋辛鈉和乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）購自上海生工公司，PCR試劑購自TAKARA公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉 10 g/L，調(diào) pH 至 7.0；YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH；SM培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）：酵母氮基6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，調(diào)pH至6.0；MM（基本培養(yǎng)基）、IM（誘導(dǎo)培養(yǎng)基）的配制參考文獻(xiàn)[6]。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化淺白隱球酵母 將含有質(zhì)粒pCAM 2300-sad的根癌農(nóng)桿菌在LB平板培養(yǎng)基（含 50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平）上劃線活化，挑取農(nóng)桿菌單克隆接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng) 18 h，離心收集菌體。用IM培養(yǎng)基重懸（含50 μg/mL卡那霉素，50 μg/mL利福平），稀釋至OD600至0.15左右，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h至OD600為0.4～0.6；接種淺白隱球酵母于10 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，按1∶5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～6 h。分別離心收集酵母和根癌農(nóng)桿菌菌體，用無菌水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體，農(nóng)桿菌濃度稀釋至OD600為0.5左右（細(xì)胞濃度約1010個(gè)/mL），酵母稀釋至OD660為0.7左右（細(xì)胞濃度約108個(gè)/mL）。各取50 μL加入10 mL IM培養(yǎng)基（含 AS 200 μmol/L）中，25℃，180 r/min 培養(yǎng)過夜后，取 100 μL培養(yǎng)液涂布鋪有微孔濾膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光培養(yǎng)2 d。

1.2.2 轉(zhuǎn)化子的篩選 將微孔濾膜轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL卡那霉素，200 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養(yǎng)基（SMⅠ）上，培養(yǎng)3～5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子和野生型淺白隱球酵母同時(shí)在含150 μg/mL卡那霉素，300 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養(yǎng)基（SMⅡ）平板上劃線，倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察其生長情況，仍能夠正常生長的可以初步認(rèn)定為是陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取及PCR鑒定采用玻璃珠法提取陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA。根據(jù)千年桐SAD基因序列設(shè)計(jì)特異引物：上游引物：5'-ATCAATCCTTTCATTTCCCAGTCTC-3'；下游引物：5'-TTATCCACCTACCATCTGCCCAC-3'。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 各影響因子的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 轉(zhuǎn)化的基本條件為農(nóng)桿菌LBA 4404預(yù)培養(yǎng)后，調(diào)至OD600為0.5左右（細(xì)胞濃度約1010/mL），酵母稀釋至OD660為0.7左右（約 108個(gè)/mL），各取 50 μL加入 10 mL IM 培養(yǎng)基（含AS 200 μmol/L）中。25℃，180 r/min培養(yǎng)過夜后，取100 μL培養(yǎng)液涂布鋪有微孔濾膜的IM（含AS 200 μmol/L）平板上，25℃倒置遮光共培養(yǎng) 48 h。對某一因子進(jìn)行研究時(shí)其他因子保持不變，單因子設(shè)置為：選用LBA 4404和AGL-1兩種農(nóng)桿菌菌株；酵母濃度分別為 1×106、2.5×106、5×106、1×107、1.5×107、2×107個(gè) /mL；農(nóng)桿菌濃度分別為 2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個(gè)/mL；共培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、36、48、60 h；共培養(yǎng)期 AS 濃度分別為 0、200、400、600、800 μmol/L。每個(gè)因子重復(fù) 3 次，觀察轉(zhuǎn)化子生長情況，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR鑒定

在SMⅠ培養(yǎng)基上篩選3 d左右后，能清晰觀察到轉(zhuǎn)化子菌落（如圖1-A），將轉(zhuǎn)化菌落與野生型淺白隱球酵母涂布在高篩選壓的SMⅡ培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)3～5 d，生長狀態(tài)如圖1-B。野生型酵母的對照不能生長，而大多數(shù)轉(zhuǎn)化子仍能正常生長。據(jù)此，初步認(rèn)仍能正常生長的為陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1 淺白隱球酵母轉(zhuǎn)化子在SM培養(yǎng)基上的生長

將初步判定的陽性轉(zhuǎn)化子接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)用野生型淺白隱球酵母做對照。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，大部分轉(zhuǎn)化子在與陽性對照相應(yīng)的部位擴(kuò)增出了特異條帶，而陰性對照沒有此條帶，這初步表明SAD基因已成功導(dǎo)入轉(zhuǎn)化子。

圖2 轉(zhuǎn)化子SAD基因的PCR鑒定

2.2 農(nóng)桿菌菌株對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

在其他條件一致的情況下，實(shí)驗(yàn)選取了LBA 4404和AGL-1兩種不同類型的農(nóng)桿菌進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，其中LBA 4404屬章魚堿型，AGL-1為典型的農(nóng)桿堿型菌株。每個(gè)菌種介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重復(fù)3次，結(jié)果顯示兩種農(nóng)桿菌菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化都能獲得陽性轉(zhuǎn)化子，但菌株AGL-1介導(dǎo)的效率明顯高于菌株LBA4404，約為其2倍，說明AGL-1更適合介導(dǎo)淺白隱球酵母的轉(zhuǎn)化。

2.3 農(nóng)桿菌濃度對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)酵母的濃度保持5×107個(gè)/mL不變時(shí)，農(nóng)桿菌LBA4404起始濃度依次為2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個(gè)/mL，其他條件保持一致。由圖3可知，農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化的影響極大，起初隨著農(nóng)桿菌濃度的增加，轉(zhuǎn)化子數(shù)目也隨之增加，但當(dāng)農(nóng)桿菌的濃度大于1×109個(gè)/mL時(shí)則會由于農(nóng)桿菌的嚴(yán)重污染而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子數(shù)量減少。因此，實(shí)驗(yàn)中農(nóng)桿菌的最佳濃度為1×109個(gè)/mL。

圖3 農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化的影響

2.4 酵母濃度對遺化轉(zhuǎn)化的影響

酵母是轉(zhuǎn)化的受體，其濃度也直接影響著轉(zhuǎn)化子數(shù)目。從圖4可以看出，隨著酵母濃度的增加，轉(zhuǎn)化子數(shù)目開始是增加的。但當(dāng)酵母濃度超過1×107個(gè)/mL時(shí)，眾多菌落擁擠在一起給轉(zhuǎn)化子的辨認(rèn)和分離造成了麻煩，同時(shí)假陽性轉(zhuǎn)化子比例增加，而酵母濃度在2×107個(gè)/mL時(shí)，假陽性比例高達(dá)80%以上。實(shí)驗(yàn)中酵母起始濃度控制在5×106至1×107個(gè)/mL之間效果最佳。

圖4 酵母濃度對轉(zhuǎn)化的影響

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

共培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)化子為0，無農(nóng)桿菌污染；共培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)化子1個(gè)，無農(nóng)桿菌污染；共培養(yǎng)36 h，轉(zhuǎn)化子14個(gè)，存在農(nóng)桿菌污染；共培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)化子23個(gè)，農(nóng)桿菌污染加重；共培養(yǎng)60 h，已無法分辨轉(zhuǎn)化子，農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重。由此可見，共培養(yǎng)時(shí)間若低于24 h，則很難獲得轉(zhuǎn)化子，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目也增多，在培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)達(dá)到最高。但培養(yǎng)時(shí)間的延長也會導(dǎo)致農(nóng)桿菌污染的加重以及篩選時(shí)農(nóng)桿菌難以抑制。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間大于60 h時(shí)，嚴(yán)重的農(nóng)桿菌污染導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子無法正常生長。

2.6 共培養(yǎng)期AS濃度

AS在培養(yǎng)中起著誘導(dǎo)農(nóng)桿菌毒性基因表達(dá)，啟動(dòng)侵染反應(yīng)的功能。在共培養(yǎng)階段，不同濃度（0、200、400、600、800 μmol/L） 的 AS 對轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果如圖5所示。在共培養(yǎng)階段缺少AS的誘導(dǎo)時(shí)，僅能獲得極少量的轉(zhuǎn)化子，但添加200 μmol/LAS后轉(zhuǎn)化效率得到顯著提高。若繼續(xù)提高AS濃度，轉(zhuǎn)化效率也不會有明顯改善，表明AS濃度為200 μmol/L時(shí)毒性基因已被充分激活。

3 小結(jié)與討論

圖5 AS濃度對轉(zhuǎn)化的影響

實(shí)驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，實(shí)現(xiàn)了千年桐SAD對淺白隱球酵母的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了陽性轉(zhuǎn)化子，并通過PCR檢測出證明SAD基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到酵母中，初步建立并優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)淺白隱球酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

不同的農(nóng)桿菌菌種具有不同的毒性，轉(zhuǎn)化得到的效率也不同，研究表明，農(nóng)桿菌AGL-1菌株在許多研究中表現(xiàn)出較高的效率[7]。實(shí)驗(yàn)選用了章魚堿型農(nóng)桿菌菌株LBA 4404和農(nóng)桿堿型菌株AG1-1為宿主，結(jié)果與上述研究一致：AGL-1介導(dǎo)的效率明顯高于LBA 4404，這可能與菌株AGL-1高活性的Vir基因有關(guān)。農(nóng)桿菌毒性基因的表達(dá)需要AS的誘導(dǎo)，AS的應(yīng)用階段主要有預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)兩個(gè)時(shí)期，而共培養(yǎng)時(shí)期的作用更為重要，大多數(shù)研究者認(rèn)為共培養(yǎng)期不加AS是不能獲得轉(zhuǎn)化子的。本實(shí)驗(yàn)在共培養(yǎng)期缺失AS的條件下也獲得了少量的轉(zhuǎn)化子，但添加AS使得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目大大的提高了，這同 Weiguo Fang等轉(zhuǎn)化綠僵霉（Metarhizium anisopliae）的結(jié)果相似。另外，實(shí)驗(yàn)中AS濃度變化對轉(zhuǎn)化影響不大，說明AS濃度為200 μmol/L時(shí)，已能充分激活農(nóng)桿菌毒性基因的表達(dá)。

農(nóng)桿菌和酵母濃度對轉(zhuǎn)化都有顯著的影響，農(nóng)桿菌和受體菌濃度太低都不能得到理想的轉(zhuǎn)化效率[8]。當(dāng)農(nóng)桿菌達(dá)到一定濃度后效率達(dá)到最高，此時(shí)農(nóng)桿菌濃度繼續(xù)增加也不能增加轉(zhuǎn)化子數(shù)量，這主要是由于受體細(xì)胞外可用于農(nóng)桿菌結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量有限，因此有研究者對農(nóng)桿菌和受體細(xì)胞數(shù)量比進(jìn)行研究，認(rèn)為這樣更能說明問題。而農(nóng)桿菌濃度過大時(shí)，后期的過度生長會與受體競爭養(yǎng)份和空間[9]而影響轉(zhuǎn)化子的正常生長，并給轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)農(nóng)桿菌的去除帶來麻煩；酵母的濃度太大，則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子不易分辨和假陽性的增加。通常篩選時(shí)可以通過增加抗生素和抑菌素濃度的方式抑制農(nóng)桿菌和假陽性轉(zhuǎn)化子的生長，但有時(shí)也會抑制，陽性轉(zhuǎn)化子的生長。在本實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌濃度為1×109個(gè)/mL，酵母為 5×106～1×107個(gè)/mL 時(shí)可以得到理想的轉(zhuǎn)化效率并保持較低的假陽性率和農(nóng)桿菌的污染。農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的切割、轉(zhuǎn)移以及整合到受體染色體DNA等過程的完成需要一定的時(shí)間，這個(gè)時(shí)間的長短受受體自身特性及轉(zhuǎn)化條件的影響而不同，低于這個(gè)臨界點(diǎn)則不能獲得轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)時(shí)間短于24 h不能得到轉(zhuǎn)化子，隨著時(shí)間的延長轉(zhuǎn)化子數(shù)目也增加，但超過60 h則會由于嚴(yán)重的農(nóng)桿菌污染。除了以上因子，共培養(yǎng)溫度[10]，培養(yǎng)基 pH[11]，載體結(jié)構(gòu)[12]，載體膜等也能影響轉(zhuǎn)化效果，這些都有待于進(jìn)一步的研究。

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