陳東亮,李紀(jì)元,范正琪,范妙華,田 敏
(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所,浙江 富陽 311400)
生物質(zhì)能源的開發(fā)利用是解決能源危機(jī)的重要途徑之一。植物油脂是生產(chǎn)生物柴油的主要原料來源,具有一定的規(guī)模,但高昂的原料成本[1]嚴(yán)重限制了該產(chǎn)業(yè)發(fā)展。利用微生物油脂為原料生產(chǎn)生物柴油的途徑不存在此問題,且具有資源豐富、油脂含量高、碳源利用廣等特點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
最適合做生物柴油的脂肪酸是:有較長的直碳鏈,最好有一個(gè)不飽和雙鍵存在脂肪酸[2]。植物中的Acyl-ACP脫飽和酶定位于質(zhì)體上,催化植物不飽和脂肪酸生物合成途徑中的第一步脫飽和反應(yīng),直接調(diào)控著飽和與不飽和脂肪酸的比例?!?硬脂酰-ACP脫飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase),簡稱:SAD,是目前研究最多、最廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化硬脂酸在第9~10碳原子之間脫氫形成第一個(gè)雙鍵,生成油酸。為提高優(yōu)良產(chǎn)油菌淺白隱球酵母(油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的65%)脂肪酸的質(zhì)量,筆者利用基因工程技術(shù)將木本油料樹種千年桐(Vernicia Montana)中的SAD基因轉(zhuǎn)入到淺白隱球酵母,期望通過調(diào)節(jié)其代謝途徑提高其油脂質(zhì)量。
與PEG-CaCl2法、醋酸鋰法、電擊法、基因槍法等傳統(tǒng)真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法相比,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)具有操作簡便、遺傳穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[3-4],因此它成為了當(dāng)前發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的遺傳轉(zhuǎn)化方法之一。筆者利用ATMT法對淺白隱球酵母進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對影響轉(zhuǎn)化結(jié)果的若干關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究探討。
1.1.1 菌株和質(zhì)粒 SAD基因(全長1 191 bp)的真菌表達(dá)載體pCAM 2300-sad由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[5],該質(zhì)粒攜帶CAMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPT II);根癌農(nóng)桿菌 LBA 4404、AGL-1(均含質(zhì)粒pCAM 2300-sad)為本所實(shí)驗(yàn)室保存;高產(chǎn)油脂的淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。
1.1.2 試 劑 卡那霉素、利福平、頭孢呋辛鈉和乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)購自上海生工公司,PCR試劑購自TAKARA公司,其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉 10 g/L,調(diào) pH 至 7.0;YPD 培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,葡萄糖20 g/L,自然pH;SM培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基):酵母氮基6.7 g/L,葡萄糖20 g/L,調(diào)pH至6.0;MM(基本培養(yǎng)基)、IM(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)的配制參考文獻(xiàn)[6]。
1.2.1 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化淺白隱球酵母 將含有質(zhì)粒pCAM 2300-sad的根癌農(nóng)桿菌在LB平板培養(yǎng)基(含 50 μg/mL卡那霉素,50 μg/mL利福平)上劃線活化,挑取農(nóng)桿菌單克隆接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL卡那霉素,50 μg/mL利福平),28℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng) 18 h,離心收集菌體。用IM培養(yǎng)基重懸(含50 μg/mL卡那霉素,50 μg/mL利福平),稀釋至OD600至0.15左右,繼續(xù)培養(yǎng)5~6 h至OD600為0.4~0.6;接種淺白隱球酵母于10 mL YPD培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后,按1∶5稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5~6 h。分別離心收集酵母和根癌農(nóng)桿菌菌體,用無菌水清洗一次,用IM培養(yǎng)基重懸菌體,農(nóng)桿菌濃度稀釋至OD600為0.5左右(細(xì)胞濃度約1010個(gè)/mL),酵母稀釋至OD660為0.7左右(細(xì)胞濃度約108個(gè)/mL)。各取50 μL加入10 mL IM培養(yǎng)基(含 AS 200 μmol/L)中,25℃,180 r/min 培養(yǎng)過夜后,取 100 μL培養(yǎng)液涂布鋪有微孔濾膜的IM(含AS 200 μmol/L)平板上,25℃倒置遮光培養(yǎng)2 d。
1.2.2 轉(zhuǎn)化子的篩選 將微孔濾膜轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL卡那霉素,200 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養(yǎng)基(SMⅠ)上,培養(yǎng)3~5 d后,將初篩得到的轉(zhuǎn)化子和野生型淺白隱球酵母同時(shí)在含150 μg/mL卡那霉素,300 μg/mL頭孢呋辛那的SM培養(yǎng)基(SMⅡ)平板上劃線,倒置培養(yǎng)3~5 d,觀察其生長情況,仍能夠正常生長的可以初步認(rèn)定為是陽性轉(zhuǎn)化子。
1.2.3 轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取及PCR鑒定采用玻璃珠法提取陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA。根據(jù)千年桐SAD基因序列設(shè)計(jì)特異引物:上游引物:5'-ATCAATCCTTTCATTTCCCAGTCTC-3';下游引物:5'-TTATCCACCTACCATCTGCCCAC-3'。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 4 min,94℃變性 30 s,57℃退火30 s,72℃延伸 1 min,30個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.4 各影響因子的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 轉(zhuǎn)化的基本條件為農(nóng)桿菌LBA 4404預(yù)培養(yǎng)后,調(diào)至OD600為0.5左右(細(xì)胞濃度約1010/mL),酵母稀釋至OD660為0.7左右(約 108個(gè)/mL),各取 50 μL加入 10 mL IM 培養(yǎng)基(含AS 200 μmol/L)中。25℃,180 r/min培養(yǎng)過夜后,取100 μL培養(yǎng)液涂布鋪有微孔濾膜的IM(含AS 200 μmol/L)平板上,25℃倒置遮光共培養(yǎng) 48 h。對某一因子進(jìn)行研究時(shí)其他因子保持不變,單因子設(shè)置為:選用LBA 4404和AGL-1兩種農(nóng)桿菌菌株;酵母濃度分別為 1×106、2.5×106、5×106、1×107、1.5×107、2×107個(gè) /mL;農(nóng)桿菌濃度分別為 2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個(gè)/mL;共培養(yǎng)時(shí)間分別為12、24、36、48、60 h;共培養(yǎng)期 AS 濃度分別為 0、200、400、600、800 μmol/L。每個(gè)因子重復(fù) 3 次,觀察轉(zhuǎn)化子生長情況,統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)量。
在SMⅠ培養(yǎng)基上篩選3 d左右后,能清晰觀察到轉(zhuǎn)化子菌落(如圖1-A),將轉(zhuǎn)化菌落與野生型淺白隱球酵母涂布在高篩選壓的SMⅡ培養(yǎng)基上,28℃倒置培養(yǎng)3~5 d,生長狀態(tài)如圖1-B。野生型酵母的對照不能生長,而大多數(shù)轉(zhuǎn)化子仍能正常生長。據(jù)此,初步認(rèn)仍能正常生長的為陽性轉(zhuǎn)化子。
圖1 淺白隱球酵母轉(zhuǎn)化子在SM培養(yǎng)基上的生長
將初步判定的陽性轉(zhuǎn)化子接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測,同時(shí)用野生型淺白隱球酵母做對照。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2??梢钥闯?,大部分轉(zhuǎn)化子在與陽性對照相應(yīng)的部位擴(kuò)增出了特異條帶,而陰性對照沒有此條帶,這初步表明SAD基因已成功導(dǎo)入轉(zhuǎn)化子。
圖2 轉(zhuǎn)化子SAD基因的PCR鑒定
在其他條件一致的情況下,實(shí)驗(yàn)選取了LBA 4404和AGL-1兩種不同類型的農(nóng)桿菌進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,其中LBA 4404屬章魚堿型,AGL-1為典型的農(nóng)桿堿型菌株。每個(gè)菌種介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重復(fù)3次,結(jié)果顯示兩種農(nóng)桿菌菌株介導(dǎo)轉(zhuǎn)化都能獲得陽性轉(zhuǎn)化子,但菌株AGL-1介導(dǎo)的效率明顯高于菌株LBA4404,約為其2倍,說明AGL-1更適合介導(dǎo)淺白隱球酵母的轉(zhuǎn)化。
當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)酵母的濃度保持5×107個(gè)/mL不變時(shí),農(nóng)桿菌LBA4404起始濃度依次為2.5×108、5×108、1×109、2×109、3×109個(gè)/mL,其他條件保持一致。由圖3可知,農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化的影響極大,起初隨著農(nóng)桿菌濃度的增加,轉(zhuǎn)化子數(shù)目也隨之增加,但當(dāng)農(nóng)桿菌的濃度大于1×109個(gè)/mL時(shí)則會由于農(nóng)桿菌的嚴(yán)重污染而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子數(shù)量減少。因此,實(shí)驗(yàn)中農(nóng)桿菌的最佳濃度為1×109個(gè)/mL。
圖3 農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化的影響
酵母是轉(zhuǎn)化的受體,其濃度也直接影響著轉(zhuǎn)化子數(shù)目。從圖4可以看出,隨著酵母濃度的增加,轉(zhuǎn)化子數(shù)目開始是增加的。但當(dāng)酵母濃度超過1×107個(gè)/mL時(shí),眾多菌落擁擠在一起給轉(zhuǎn)化子的辨認(rèn)和分離造成了麻煩,同時(shí)假陽性轉(zhuǎn)化子比例增加,而酵母濃度在2×107個(gè)/mL時(shí),假陽性比例高達(dá)80%以上。實(shí)驗(yàn)中酵母起始濃度控制在5×106至1×107個(gè)/mL之間效果最佳。
圖4 酵母濃度對轉(zhuǎn)化的影響
共培養(yǎng)12 h,轉(zhuǎn)化子為0,無農(nóng)桿菌污染;共培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)化子1個(gè),無農(nóng)桿菌污染;共培養(yǎng)36 h,轉(zhuǎn)化子14個(gè),存在農(nóng)桿菌污染;共培養(yǎng)48 h,轉(zhuǎn)化子23個(gè),農(nóng)桿菌污染加重;共培養(yǎng)60 h,已無法分辨轉(zhuǎn)化子,農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重。由此可見,共培養(yǎng)時(shí)間若低于24 h,則很難獲得轉(zhuǎn)化子,隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長,獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目也增多,在培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)達(dá)到最高。但培養(yǎng)時(shí)間的延長也會導(dǎo)致農(nóng)桿菌污染的加重以及篩選時(shí)農(nóng)桿菌難以抑制。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間大于60 h時(shí),嚴(yán)重的農(nóng)桿菌污染導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子無法正常生長。
AS在培養(yǎng)中起著誘導(dǎo)農(nóng)桿菌毒性基因表達(dá),啟動(dòng)侵染反應(yīng)的功能。在共培養(yǎng)階段,不同濃度(0、200、400、600、800 μmol/L) 的 AS 對轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果如圖5所示。在共培養(yǎng)階段缺少AS的誘導(dǎo)時(shí),僅能獲得極少量的轉(zhuǎn)化子,但添加200 μmol/LAS后轉(zhuǎn)化效率得到顯著提高。若繼續(xù)提高AS濃度,轉(zhuǎn)化效率也不會有明顯改善,表明AS濃度為200 μmol/L時(shí)毒性基因已被充分激活。
圖5 AS濃度對轉(zhuǎn)化的影響
實(shí)驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,實(shí)現(xiàn)了千年桐SAD對淺白隱球酵母的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得了陽性轉(zhuǎn)化子,并通過PCR檢測出證明SAD基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到酵母中,初步建立并優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)淺白隱球酵母的遺傳轉(zhuǎn)化體系。
不同的農(nóng)桿菌菌種具有不同的毒性,轉(zhuǎn)化得到的效率也不同,研究表明,農(nóng)桿菌AGL-1菌株在許多研究中表現(xiàn)出較高的效率[7]。實(shí)驗(yàn)選用了章魚堿型農(nóng)桿菌菌株LBA 4404和農(nóng)桿堿型菌株AG1-1為宿主,結(jié)果與上述研究一致:AGL-1介導(dǎo)的效率明顯高于LBA 4404,這可能與菌株AGL-1高活性的Vir基因有關(guān)。農(nóng)桿菌毒性基因的表達(dá)需要AS的誘導(dǎo),AS的應(yīng)用階段主要有預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)兩個(gè)時(shí)期,而共培養(yǎng)時(shí)期的作用更為重要,大多數(shù)研究者認(rèn)為共培養(yǎng)期不加AS是不能獲得轉(zhuǎn)化子的。本實(shí)驗(yàn)在共培養(yǎng)期缺失AS的條件下也獲得了少量的轉(zhuǎn)化子,但添加AS使得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目大大的提高了,這同 Weiguo Fang等轉(zhuǎn)化綠僵霉(Metarhizium anisopliae)的結(jié)果相似。另外,實(shí)驗(yàn)中AS濃度變化對轉(zhuǎn)化影響不大,說明AS濃度為200 μmol/L時(shí),已能充分激活農(nóng)桿菌毒性基因的表達(dá)。
農(nóng)桿菌和酵母濃度對轉(zhuǎn)化都有顯著的影響,農(nóng)桿菌和受體菌濃度太低都不能得到理想的轉(zhuǎn)化效率[8]。當(dāng)農(nóng)桿菌達(dá)到一定濃度后效率達(dá)到最高,此時(shí)農(nóng)桿菌濃度繼續(xù)增加也不能增加轉(zhuǎn)化子數(shù)量,這主要是由于受體細(xì)胞外可用于農(nóng)桿菌結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量有限,因此有研究者對農(nóng)桿菌和受體細(xì)胞數(shù)量比進(jìn)行研究,認(rèn)為這樣更能說明問題。而農(nóng)桿菌濃度過大時(shí),后期的過度生長會與受體競爭養(yǎng)份和空間[9]而影響轉(zhuǎn)化子的正常生長,并給轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)農(nóng)桿菌的去除帶來麻煩;酵母的濃度太大,則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子不易分辨和假陽性的增加。通常篩選時(shí)可以通過增加抗生素和抑菌素濃度的方式抑制農(nóng)桿菌和假陽性轉(zhuǎn)化子的生長,但有時(shí)也會抑制,陽性轉(zhuǎn)化子的生長。在本實(shí)驗(yàn)中,共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌濃度為1×109個(gè)/mL,酵母為 5×106~1×107個(gè)/mL 時(shí)可以得到理想的轉(zhuǎn)化效率并保持較低的假陽性率和農(nóng)桿菌的污染。農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的切割、轉(zhuǎn)移以及整合到受體染色體DNA等過程的完成需要一定的時(shí)間,這個(gè)時(shí)間的長短受受體自身特性及轉(zhuǎn)化條件的影響而不同,低于這個(gè)臨界點(diǎn)則不能獲得轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)時(shí)間短于24 h不能得到轉(zhuǎn)化子,隨著時(shí)間的延長轉(zhuǎn)化子數(shù)目也增加,但超過60 h則會由于嚴(yán)重的農(nóng)桿菌污染。除了以上因子,共培養(yǎng)溫度[10],培養(yǎng)基 pH[11],載體結(jié)構(gòu)[12],載體膜等也能影響轉(zhuǎn)化效果,這些都有待于進(jìn)一步的研究。
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