桿菌肽的生物法檢測及發(fā)酵條件研究

周 欣 ，張 麗 ，李雄飛

（1.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 保定 071000；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071001；3北京正大集團(tuán)，北京 101301）

桿菌肽是由地衣芽孢桿菌或枯草桿菌變種的培養(yǎng)液分離而得。桿菌肽對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用，抗菌譜與青霉素G相似，主要用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染，還可用作飼料添加劑。[1]。目前桿菌肽的工業(yè)生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵法制得，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是目前廣泛應(yīng)用的工業(yè)生產(chǎn)菌種。我國的桿菌肽發(fā)酵生產(chǎn)始于20世紀(jì)60年代，隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的興起，于上個世紀(jì)90年代開始大量生產(chǎn)桿菌肽，以芽孢桿菌為菌種，玉米和豆粕為主要原料，通過生物發(fā)酵、鋅絡(luò)合制備而成[2]。試驗(yàn)對桿菌肽的生物法檢測和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

1 材料

（1）菌株：地衣芽孢桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存。

（2）主要培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液、營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)液：丙三醇15 g，谷氨酸0.5 g，磷酸鈉14.3 g，硫酸鎂0.025g，蒸餾水 1000mL，pH7.5。

（3）主要儀器：低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造），PHS－3C數(shù)字酸度計(jì)，光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-CH2），724微機(jī)型可見分光光度儀（上海光學(xué)儀器制造廠）。

2 方法

2.1 地衣芽孢桿菌的生長曲線測定

將菌株接入第一瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，12小時后將菌接入第二瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。從第二瓶接入種開始計(jì)時，每隔30 min同時取兩瓶中的培養(yǎng)液用722分光光度計(jì)測其在600 nm的OD值，測定該菌株生長曲線[3]。

2.2 地衣芽孢桿菌的發(fā)酵時間的影響

將250 mL三角瓶中，裝40 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，菌接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)備用；500 mL三角瓶中裝40 mL發(fā)酵液，按10%的接種量將備用菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)。培養(yǎng) 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣，4000 r/min 離心 10 min，取上清，以此標(biāo)記為 A、B、C、D、E、F、G，放冰箱下層（-20 ℃）保存[4]。

2.3 抑菌溶液的配制

（1）樣品發(fā)酵液的稀釋：將B、C發(fā)酵培養(yǎng)液的上清液按估計(jì)值 600 u/mL稀釋至 1 u/mL和 4 u/mL；D、E、F、G 發(fā)酵液按800u/mL稀釋至1u/mL和4u/mL，稀釋方法如下：

稀釋至4u/mL，見表1。

表1 發(fā)酵液按估計(jì)濃度稀釋至4 u/mL加樣表

稀釋至1 u/mL

取4 u/mL的樣品發(fā)酵液稀釋液1 mL，與pH6.0的磷酸緩沖液3mL混合得到。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋：取0.2 g 53.5 u/mg的標(biāo)準(zhǔn)品，用0.01 M鹽酸，定容至100 mL，配成100 u/mL的備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ。取備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液110 mL，用0.01 M鹽酸，定容至100 mL，配成10 u/mL的備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ。按下表，取儲備標(biāo)準(zhǔn)液Ⅱ與0.01 M鹽酸，用pH6.0的磷酸緩沖液定到100 mL。得到濃度為1 u/mL和4 u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至1u/mL和4u/mL加樣表

2.4 桿菌肽產(chǎn)量生物法測定

每個藤黃八疊雙層平板上放置4個牛津杯，其中一條對角線上的兩個牛津杯中分別注入濃度為1 u/mL和4 u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；另一條對角線上分別注入取樣品發(fā)酵液稀釋到的 1 u/mL和 4 u/mL濃度的溶液[5]。

3 結(jié)果

3.1 地衣芽孢桿菌的生長曲線測定

結(jié)果如圖1可知其生長對數(shù)期在4～12 h之間，選擇10 h做為種子培養(yǎng)時間。

圖1 地衣芽孢桿菌生長曲線圖

3.2 芽孢桿菌的發(fā)酵時間的影響

培養(yǎng) 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣，4000 r/min離心10 min，取上清，以此標(biāo)記為，放冰箱下層（-20℃）保存。

抑菌實(shí)驗(yàn)：通過生物法測定 A、B、C、D、E、F、G 7 個樣品中桿菌肽的抑菌情況。結(jié)果見表3。

表3 不同抑菌時間抑菌直徑測量數(shù)據(jù)表

P為樣品發(fā)酵液的效價(jià)濃度

AT為樣品發(fā)酵液的估計(jì)濃度

S1為濃度為1u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的抑菌圈直徑

S4為濃度為4u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的抑菌圈直徑

T1為濃度為1u/mL的樣品發(fā)酵液的抑菌圈直徑

T4為濃度為4u/mL的樣品發(fā)酵液的抑菌圈直徑

應(yīng)用公式：P=（T1+T4）/（S1+S4）*AT計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 不同時間發(fā)酵液桿菌肽含量表

根據(jù)表4得到桿菌肽的產(chǎn)生趨勢：

圖2 桿菌肽產(chǎn)生趨勢圖

由圖2可知，在發(fā)酵的前期（6～24 h），桿菌肽產(chǎn)生呈上升趨勢；在發(fā)酵的中后期（24～54 h），桿菌肽的產(chǎn)量穩(wěn)定，綜合分析以及從成本考慮得到桿菌肽的產(chǎn)生情況為：選擇發(fā)酵35 h，桿菌肽產(chǎn)量為，642.7 u/mL。

4 結(jié)語

通過對桿菌肽產(chǎn)生菌進(jìn)行初步發(fā)酵條件摸索，首先將篩選到的菌株在營養(yǎng)肉湯細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行種子瓶培養(yǎng)，通過間隔時間取樣測量菌體密度，確定種子瓶生長曲線。選擇菌體量較大，且菌體活力旺盛的對數(shù)生長后期作為發(fā)酵培養(yǎng)基的接種時間。這樣可保證菌株盡快繁殖代謝，以產(chǎn)生我們需要的桿菌肽。最終，實(shí)驗(yàn)確定搖瓶培養(yǎng)10 h為種子瓶最佳時間。

發(fā)酵過程中，桿菌肽的生物檢測采用2005版中國獸藥藥典規(guī)定的抑菌圈法。生物法檢測儀器要求不高，通過發(fā)酵液對敏感菌藤花八疊球菌的抑菌圈直徑大小確定桿菌肽效價(jià)，為避免測量過程中各個平皿之間的誤差，每個平皿采用桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品同時測定，以校正誤差。通過對桿菌肽發(fā)酵過程監(jiān)控，確定桿菌肽的產(chǎn)生情況為：選擇發(fā)酵35 h，桿菌肽產(chǎn)量為，642.7 u/mL。

[1]Raussens V，Narayanaswan V，Goormaghtigh E，et al.Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phospholipids-bund states[J].J Biol chem，1999，27（4）：89-95.

[2]薛志成.桿菌肽鋅在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用.養(yǎng)殖與飼料[J].飼料與營養(yǎng)，2006，（1）：23-24.

[3]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[4]沈萍.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2002.