周 欣 ,張 麗 ,李雄飛
(1.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 保定 071000;2河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北 保定 071001;3北京正大集團(tuán),北京 101301)
桿菌肽是由地衣芽孢桿菌或枯草桿菌變種的培養(yǎng)液分離而得。桿菌肽對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用,抗菌譜與青霉素G相似,主要用于治療耐青霉素的葡萄球菌感染,還可用作飼料添加劑。[1]。目前桿菌肽的工業(yè)生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵法制得,地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是目前廣泛應(yīng)用的工業(yè)生產(chǎn)菌種。我國的桿菌肽發(fā)酵生產(chǎn)始于20世紀(jì)60年代,隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的興起,于上個世紀(jì)90年代開始大量生產(chǎn)桿菌肽,以芽孢桿菌為菌種,玉米和豆粕為主要原料,通過生物發(fā)酵、鋅絡(luò)合制備而成[2]。試驗(yàn)對桿菌肽的生物法檢測和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。
(1)菌株:地衣芽孢桿菌,本實(shí)驗(yàn)室保存。
(2)主要培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液、營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)液:丙三醇15 g,谷氨酸0.5 g,磷酸鈉14.3 g,硫酸鎂0.025g,蒸餾水 1000mL,pH7.5。
(3)主要儀器:低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造),PHS-3C數(shù)字酸度計(jì),光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-CH2),724微機(jī)型可見分光光度儀(上海光學(xué)儀器制造廠)。
將菌株接入第一瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng),12小時后將菌接入第二瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)。從第二瓶接入種開始計(jì)時,每隔30 min同時取兩瓶中的培養(yǎng)液用722分光光度計(jì)測其在600 nm的OD值,測定該菌株生長曲線[3]。
將250 mL三角瓶中,裝40 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,菌接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min培養(yǎng)備用;500 mL三角瓶中裝40 mL發(fā)酵液,按10%的接種量將備用菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中,37 ℃,200 r/min 培養(yǎng)。培養(yǎng) 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣,4000 r/min 離心 10 min,取上清,以此標(biāo)記為 A、B、C、D、E、F、G,放冰箱下層(-20 ℃)保存[4]。
(1)樣品發(fā)酵液的稀釋:將B、C發(fā)酵培養(yǎng)液的上清液按估計(jì)值 600 u/mL稀釋至 1 u/mL和 4 u/mL;D、E、F、G 發(fā)酵液按800u/mL稀釋至1u/mL和4u/mL,稀釋方法如下:
稀釋至4u/mL,見表1。
表1 發(fā)酵液按估計(jì)濃度稀釋至4 u/mL加樣表
稀釋至1 u/mL
取4 u/mL的樣品發(fā)酵液稀釋液1 mL,與pH6.0的磷酸緩沖液3mL混合得到。
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋:取0.2 g 53.5 u/mg的標(biāo)準(zhǔn)品,用0.01 M鹽酸,定容至100 mL,配成100 u/mL的備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ。取備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液110 mL,用0.01 M鹽酸,定容至100 mL,配成10 u/mL的備儲標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ。按下表,取儲備標(biāo)準(zhǔn)液Ⅱ與0.01 M鹽酸,用pH6.0的磷酸緩沖液定到100 mL。得到濃度為1 u/mL和4 u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,見表2。
表2 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至1u/mL和4u/mL加樣表
每個藤黃八疊雙層平板上放置4個牛津杯,其中一條對角線上的兩個牛津杯中分別注入濃度為1 u/mL和4 u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;另一條對角線上分別注入取樣品發(fā)酵液稀釋到的 1 u/mL和 4 u/mL濃度的溶液[5]。
結(jié)果如圖1可知其生長對數(shù)期在4~12 h之間,選擇10 h做為種子培養(yǎng)時間。
圖1 地衣芽孢桿菌生長曲線圖
培養(yǎng) 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 時取樣,4000 r/min離心10 min,取上清,以此標(biāo)記為,放冰箱下層(-20℃)保存。
抑菌實(shí)驗(yàn):通過生物法測定 A、B、C、D、E、F、G 7 個樣品中桿菌肽的抑菌情況。結(jié)果見表3。
表3 不同抑菌時間抑菌直徑測量數(shù)據(jù)表
P為樣品發(fā)酵液的效價(jià)濃度
AT為樣品發(fā)酵液的估計(jì)濃度
S1為濃度為1u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的抑菌圈直徑
S4為濃度為4u/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的抑菌圈直徑
T1為濃度為1u/mL的樣品發(fā)酵液的抑菌圈直徑
T4為濃度為4u/mL的樣品發(fā)酵液的抑菌圈直徑
應(yīng)用公式:P=(T1+T4)/(S1+S4)*AT計(jì)算,結(jié)果見表4。
表4 不同時間發(fā)酵液桿菌肽含量表
根據(jù)表4得到桿菌肽的產(chǎn)生趨勢:
圖2 桿菌肽產(chǎn)生趨勢圖
由圖2可知,在發(fā)酵的前期(6~24 h),桿菌肽產(chǎn)生呈上升趨勢;在發(fā)酵的中后期(24~54 h),桿菌肽的產(chǎn)量穩(wěn)定,綜合分析以及從成本考慮得到桿菌肽的產(chǎn)生情況為:選擇發(fā)酵35 h,桿菌肽產(chǎn)量為,642.7 u/mL。
通過對桿菌肽產(chǎn)生菌進(jìn)行初步發(fā)酵條件摸索,首先將篩選到的菌株在營養(yǎng)肉湯細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行種子瓶培養(yǎng),通過間隔時間取樣測量菌體密度,確定種子瓶生長曲線。選擇菌體量較大,且菌體活力旺盛的對數(shù)生長后期作為發(fā)酵培養(yǎng)基的接種時間。這樣可保證菌株盡快繁殖代謝,以產(chǎn)生我們需要的桿菌肽。最終,實(shí)驗(yàn)確定搖瓶培養(yǎng)10 h為種子瓶最佳時間。
發(fā)酵過程中,桿菌肽的生物檢測采用2005版中國獸藥藥典規(guī)定的抑菌圈法。生物法檢測儀器要求不高,通過發(fā)酵液對敏感菌藤花八疊球菌的抑菌圈直徑大小確定桿菌肽效價(jià),為避免測量過程中各個平皿之間的誤差,每個平皿采用桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品同時測定,以校正誤差。通過對桿菌肽發(fā)酵過程監(jiān)控,確定桿菌肽的產(chǎn)生情況為:選擇發(fā)酵35 h,桿菌肽產(chǎn)量為,642.7 u/mL。
[1]Raussens V,Narayanaswan V,Goormaghtigh E,et al.Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phospholipids-bund states[J].J Biol chem,1999,27(4):89-95.
[2]薛志成.桿菌肽鋅在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用.養(yǎng)殖與飼料[J].飼料與營養(yǎng),2006,(1):23-24.
[3]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.
[4]沈萍.微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2002.