薛愛華，宋文靜

（天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，天津 300102）

骨質(zhì)丸Ⅱ主要由熟地黃、骨碎補(bǔ)、制何首烏、肉蓯蓉、墨旱蓮、鹿銜草、女貞子、雞血藤、益智仁、淫羊藿組成，具有補(bǔ)肝益腎，活血化瘀，軟堅(jiān)止痛的功效。本實(shí)驗(yàn)選擇該制劑中的何首烏所含的有效成分2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷作為定量測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法對(duì)何首烏進(jìn)行含量測定。

1 儀器與試藥

儀器：SHIMADZU LC-2010C高效液相色譜儀，CLASS-VP 工作站。對(duì)照品：2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷為對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所購置，批號(hào)：110844-200505；為含量測定用對(duì)照品）；骨質(zhì)丸Ⅱ樣品：本院制劑室提供。

試劑：乙腈，色譜純；水，去離子水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（17∶83）為流動(dòng)相；檢測波長為 320nm；柱溫為40℃；流速為1.0 mL/min。理論板數(shù)按2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷峰計(jì)算不低于4000。[1]

2.2 檢測波長的選擇 采用藥典檢測2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷常用波長320 nm為本實(shí)驗(yàn)的檢測波長[1]。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷為對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。結(jié)果見圖1。

2.4 供試品溶液的制備 取同一批號(hào)（081028）質(zhì)量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流45 min，放冷，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，見圖2。

2.5 陰性樣品溶液的制備 按處方取除制何首烏的各味藥材，按骨質(zhì)丸Ⅱ制備工藝制得樣品，再按“2.4”供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。精密吸取 10 μL，注入液相色譜儀。與 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷為對(duì)照品色譜峰相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處，無色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品溶液無干擾。結(jié)果見圖3。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷為對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含0.0315 mg的溶液作為儲(chǔ)備液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各2、4、7、12、18、25 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=3.9015×106X-32865，r=0.9999。結(jié)果表明 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷為對(duì)照品在0.0630～0.7875 μg范圍內(nèi)線性良好，結(jié)果見表1。

表 1 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 The standard curve of control substance of 2,3,5,4,-tetrahydroxy diphenyl ethylene-2-0-β-D-glucoside

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（081028）質(zhì)量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，取約2g，按照“2.4”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷峰面積，測得峰面積值的相對(duì)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為0.88%，符合要求。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（081028）質(zhì)量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，取約2 g，按照“2.4供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，分別在 0、4、8、12、16、20、24 h，測定樣品中 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷面積，測得峰面積值的RSD為0.64%，符合要求。

2.9 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（081028）質(zhì)量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，取約2 g，按照“2.4”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測定每份樣品中2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷含量。結(jié)果樣品中 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷平均含量為 0.6312 mg/g，RSD為1.13%，符合要求。

2.10 回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（081028）質(zhì)量差異項(xiàng)下的本品，剪碎，取約1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入每 mL 含 0.02576 mg的 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液25 mL，再精密加入稀乙醇 25 mL，再按照“2.4”供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.37%，RSD為1.76%。

2.11 樣品測定 取另一批號(hào)（080811）的樣品，按照“2.4”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件測定樣品中 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷含量。結(jié)果平均值（mg/g）為0.6487。

2.12 含量限度的制定 處方中，1 g制何首烏中含2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷mg，參照《中國藥典》2005年版一部項(xiàng)下含量限度計(jì)算，每 g 含制何首烏以 2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷（C20H22O9）計(jì)，不得少于 0.04 mg。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)入樣品進(jìn)行75%乙醇、稀乙醇提取溶劑進(jìn)行選擇，結(jié)果以稀乙醇含量較高，故以稀乙醇為提取溶劑。比較稀乙醇加熱回流與超聲處理2種提取方法，加熱回流結(jié)果高于超聲處理，故將加熱回流提取方式列入為本實(shí)驗(yàn)提取方法。又通過對(duì)不同加回流提取時(shí)間的比較，結(jié)果加熱回流45 min含量較高，故將提取時(shí)間確定為45 min，以此來制備供試品溶液。本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

[1] 國家藥檢委員會(huì).中國藥典一部附錄[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:33-35.