HPLC法測定梔黃滴眼液中梔子苷的含量

郭 偉 趙惠萍

梔黃滴眼液為天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科臨床有效制劑。該藥是由梔子、大黃等中藥組成，具有清熱瀉火，解毒明目之功效，用于細菌性結膜炎、角膜炎、流行性角膜炎、結膜炎、沙眼、麥粒腫、霰粒腫等病癥，多年臨床應用，療效顯著。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對不同批號梔黃滴眼液中有效成分梔子苷進行了含量測定，結果方法簡單、重現(xiàn)性好，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（LC-10AT vp SPD-10A vp N2000數(shù)據(jù)工作站 浙江大學智能信息研究所）；色譜柱：Inertex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梔子苷對照品（中國藥品生物制品檢定所 批號：110749－200613）；梔黃滴眼液（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供批號：071212，080520，0426-258-4）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為雙蒸水。

2 色譜條件

色譜柱:Inertex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈—水（13∶87）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：238 nm；理論板數(shù)按梔子苷峰計算不低于3 000。

3 方法學考察

3.1 檢測波長的確定 用貝克曼高效液相色譜儀，在190～600 nm進行波長掃描，梔子苷在238 nm處有最大吸收峰，根據(jù)《中國藥典》2005年版一部梔子項下，確定238 nm為檢測波長。

3.2 供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結果見圖1。

3.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及滴眼液制備工藝制備缺梔子的陰性樣品，再按“3.2”供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。結果見圖1。

3.4 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品適量,用50%甲醇制成每1 mL含35 μg的溶液，作為對照品溶液。結果見圖1。

圖1 紫外線吸收光譜

3.5 線性關系考察 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.172 mg的溶液，作為貯備液，再分別精密量取 5、10、15、20 mL，置 25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述4種濃度的對照品溶液與貯備液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2”色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品濃度（g/L）為縱坐標，峰面積值為橫坐標，求得回歸方程：Y=7.67E－008X。r=0.999 9。結果表明梔子苷在0.688～3.44 μg范圍內(nèi)線性良好。

3.6 重復性試驗 取同一批號（080520）樣品，取1份，精密量取10 mL，按照“3.2”供試品溶液制備操作，按“2”色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測定樣品中梔子苷峰面積，測得峰面積值的RSD為1.3%，符合要求。

3.7 穩(wěn)定性實驗 取同一批號（080520）樣品，取1份，精密量取10 mL，按照“3.2”供試品溶液制備操作，按“2”色譜條件分析，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8 h，測定樣品中梔子苷峰面積，測得峰面積值的RSD為2.1%，符合要求。

3.8 重現(xiàn)性實驗 取同一批號（080520）樣品，共6份，精密量取10 mL，按照“3.2”供試品溶液制備操作，按“2”色譜條件分析，測定每份樣品中梔子苷含量。結果樣品中梔子苷平均含量為0.19g/L，相對均屬標準±偏差值（RSD）為2.8%，符合要求。

3.9 加樣回收率試驗 取同一批號樣品（批號080520，含量為0.19g/L），共6份，各精密量取5mL，分別加入梔子苷對照品溶液0.190g/L各5 mL，再按照“3.2”供試品溶液制備操作，制得供回收率試驗用供試品溶液，按“2”色譜條件分析，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率測定結果（n=3）

3.10 樣品含量測定 取3個批號（071212，080520，0426－258－4）樣品，按照“3.2”供試品溶液制備操作，按“2”色譜條件測定樣品中梔子苷含量。按外標法計算梔子苷含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

4 討論

供試品溶液制備時曾對樣品取樣量及提取溶劑進行了考察,當取樣量為10 mL時，用甲醇、50%甲醇提取梔子苷含量相近，由于甲醇提取的供試品溶液稍有沉淀，為避免污染色譜柱，所以選擇50%甲醇為提取溶劑。對流動相進行篩選，結果乙腈—水（13：87）時，保留時間為 13 min，峰形較好，分離度、拖尾因子等均可。該方法經(jīng)方法學考察，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及回收率均較好，陰性實驗無干擾，可作為梔黃滴眼劑質(zhì)量控制的一個指標。