王偉文,廖曉陽(yáng),吳渝憲,王慶松

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (Duchenne muscular dystrophy,DMD)和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (Becker muscular dystrophy,BMD)是男性最常見(jiàn)的 X連鎖隱性遺傳病。目前已經(jīng)確認(rèn) DMD的致病基因位于 X染色體短臂 XP21上,并編碼 427 k D的抗肌萎縮蛋白 (dystrophin,Dys)。Dys分布于骨骼肌細(xì)胞膜的質(zhì)膜面,起細(xì)胞支架作用,Dys表達(dá)障礙可導(dǎo)致肌纖維膜的不穩(wěn)定及肌纖維細(xì)胞壞死,最終導(dǎo)致DMD或 BMD不同的臨床表型[1]。盡管Dys在 DMD/BMD患者肌細(xì)胞中的表達(dá)缺乏已經(jīng)明確,但其表達(dá)形式與臨床表型的關(guān)系以及在其他類(lèi)型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者肌組織中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)還少有報(bào)道?，F(xiàn)應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)我科近 10年來(lái)所搜集的 DMD、BMD、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良 (facioscapulohumeral muscular dystrophy,FSHD)和神經(jīng)性肌萎縮患者的肌組織進(jìn)行 Dys檢測(cè),并結(jié)合其不同的臨床表型從蛋白分子機(jī)制上加以探討,為肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的診斷、分型及預(yù)后判定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 DMD患者 71例,BMD患者17例,均為漢族男性?；颊呔螪MD/BMD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),并按運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí) (由輕到重分Ⅰ ～Ⅹ級(jí))。另外搜集 LGMD患者 8例,FSHD患者 4例,神經(jīng)源性肌萎縮患者 11例,所有患者來(lái)源于我院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診。對(duì)照組為無(wú)神經(jīng)肌肉疾病的急診創(chuàng)傷患者。

1.2 組織病理標(biāo)本制備 選擇患者輕、中度受累的肌肉組織,在局麻無(wú)菌情況下行肌肉組織活檢術(shù),將修剪后的組織塊放入液氮冷卻的異戊烷中快速冷凍,并置于液氮中保存。

1.3 免疫組化染色 冷凍切片厚約 4 μm,抗 Dys特異性抗體 Anti5-7由第四軍醫(yī)大學(xué)分子生物技術(shù)中心惠贈(zèng),使用效價(jià)為 1∶2 500,鏈菌素親生物素 -過(guò)氧化物酶免疫組化試劑盒購(gòu)置 Maxim Biotech公司。組化程序參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。DAB-H2O2顯色,并用蘇木素復(fù)染胞核,設(shè)立陰性空白對(duì)照和正常人組織標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料的組間比較采用 t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dys在 DMD/BMD患者肌肉組織中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示,Dys在正常對(duì)照的肌肉組織中呈陽(yáng)性表達(dá),且沿肌細(xì)胞膜分布 (見(jiàn)圖 1a)。71例臨床表型為 DMD的患者中,有63例肌細(xì)胞中未檢測(cè)到 Dys陽(yáng)性表達(dá),細(xì)胞膜邊界不可見(jiàn),細(xì)胞核排列紊亂 (見(jiàn)圖 1b);有 8例肌細(xì)胞膜上檢測(cè)到 Dys呈弱陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為 11%,可見(jiàn) Dys呈不連續(xù)的斑片狀,沿肌細(xì)胞膜分布。17例臨床表型為 BMD的患者肌細(xì)胞膜上可染出不連續(xù)的斑片狀,Dys呈弱陽(yáng)性表達(dá) (見(jiàn)圖1c)。

2.2 肌肉組織中有無(wú) Dys表達(dá)的 DMD患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)情況及年齡和病程比較 肌肉組織中無(wú) Dys陽(yáng)性表達(dá)的DMD患者,其運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)≥Ⅲ級(jí),而肌肉組織中 Dys呈陽(yáng)性表達(dá)的 DMD患者,其運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)為Ⅱ級(jí)。肌肉組織中有無(wú) Dys表達(dá)的 DMD患者的年齡、病程間差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見(jiàn)表 1)。

2.3 Dys在其他肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者肌肉組織中的表達(dá) 8例 LGMD,4例 FSHD,11例神經(jīng)源性肌萎縮患者的肌肉組織中均檢測(cè)到 Dys陽(yáng)性表達(dá),并且完整的勾畫(huà)出肌細(xì)胞膜的邊界,但肌纖維橫徑明顯縮小并粗細(xì)不一 (見(jiàn)圖1d)。

表 1 肌肉組織中有無(wú)Dys表達(dá)的 DMD患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)情況及年齡和病程的比較Table 1 The relation between dystrophin in muscle and dyskinesia grade from DMD or BMD

圖 1 a.Dys在正常人肌細(xì)胞膜上呈陽(yáng)性表達(dá) (SP法 ×400);b.Dys在 DMD患者肌肉組織中呈陰性表達(dá),細(xì)胞膜邊界不可見(jiàn),細(xì)胞核排列紊亂 (SP法 ×400);c.Dys在 BMD患者肌肉細(xì)胞膜上呈斑片狀、不連續(xù)的弱陽(yáng)性表達(dá) (SP法 ×400);d.Dys在神經(jīng)源性肌萎縮患者的肌細(xì)胞膜上呈陽(yáng)性表達(dá),肌纖維橫徑粗細(xì)不一 (SP法 ×100)Figure 1 a.Positive dystrophin immunostaining was localized to the sarcolemma from the nomal individusls(SP×400);b.No detectable dystrophin in muscle of DMD(SP×400);c.Thin dystrophin immunostaining from BMD consisted of a patchy or discontinuous staining pattern aroud most fibers(SP×400);d.Positive dystrophin immunostaining was detected in sarcolemma from the muscle of neurologic dystriophy,and fiber diameter wasvariable(SP×100)

3 討論

Dys是 DMD基因的表達(dá)產(chǎn)物,含3 685個(gè)氨基酸,分子量約 427 kD,主要分布于肌細(xì)胞的質(zhì)膜面,是橫紋肌細(xì)胞膜骨架蛋白的重要組成部分,其在保護(hù)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、維持肌細(xì)胞正常收縮功能中起重要作用。該蛋白分為 4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域:N端區(qū)、棒狀區(qū)、半胱氨酸富集區(qū)和C端區(qū)[1]。

Anti5-7多克隆抗體是針對(duì) Dys棒狀區(qū) 15-18重復(fù)區(qū)域的抗體。以往的研究表明,該抗體能特異地檢測(cè)到正常人肌細(xì)胞膜上的 Dys表達(dá)[2]。本研究結(jié)果提示,71例臨床表型為 DMD的患者中,63例患者肌細(xì)胞上未檢測(cè)到 Dys的表達(dá),8例患者的肌細(xì)胞膜上可檢測(cè)到斑片狀、不連續(xù)的 Dys弱陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率為 11%。再將這 8例患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)、年齡、病程與上述 63例 DMD患者相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在他們年齡、病程均較接近的情況下,Dys呈弱陽(yáng)性表達(dá)的患者,其運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí)較 Dys陰性表達(dá)的患者低,亦即 Dys弱陽(yáng)性表達(dá)患者的癥狀較陰性表達(dá)患者的癥狀輕。多數(shù)臨床表型為 DMD的患者其肌細(xì)胞膜上缺乏 Dys的表達(dá),這與我們以往的研究結(jié)果相一致。而就另外8例臨床表型考慮 DMD的患者而言,可能因 DMD基因突變?cè)斐赏怙@子以外區(qū)域的移碼,仍部分維持了開(kāi)放閱讀框架的完整性,而產(chǎn)生一個(gè)具有部分功能、短小的小分子蛋白,對(duì)肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的維持起到一定的作用,而表現(xiàn)為一個(gè)較輕的臨床表型。當(dāng)然,這 8例患者是否是BMD有待于我們今后進(jìn)一步的臨床隨訪。

與 DMD相比,BMD有著較輕的臨床表型及較低的發(fā)病率。17例臨床表型為BMD的患者其肌肉組織中均檢測(cè)到 Dys弱陽(yáng)性表達(dá),且呈斑片狀沿肌細(xì)胞膜分布。根據(jù)開(kāi)放閱讀框架學(xué)說(shuō),當(dāng)基因突變時(shí),若鄰近外顯子仍能維持開(kāi)放閱讀框架不變,則產(chǎn)生一個(gè)尚有部分功能的 Dys,由于該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能不同于正常的Dys,致使肌細(xì)胞膜的通透性、穩(wěn)定性發(fā)生了改變,而表現(xiàn)為一個(gè)較 DMD輕的臨床表型[3-4]。結(jié)合上述 8例存在少量 Dys表達(dá)的患者的臨床運(yùn)動(dòng)功能障礙分級(jí),可以推斷 Dys是否表達(dá)及其質(zhì)或量的改變是我們推斷肌營(yíng)養(yǎng)不良癥臨床表型及判定臨床預(yù)后的重要依據(jù)。

進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥除了 DMD、BMD外,還包括先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、FSHD及 LGMD等。本研究對(duì) 8例 LGMD,4例 FSHD患者的肌肉組織 Dys檢測(cè)的結(jié)果顯示,患者肌細(xì)胞膜上均檢測(cè)到 Dys陽(yáng)性表達(dá)。該結(jié)果也預(yù)示著這兩類(lèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的病理機(jī)制與Dys表達(dá)無(wú)關(guān)。另外,本研究對(duì) 11例神經(jīng)源性肌萎縮患者肌肉組織 Dys檢測(cè)結(jié)果顯示,該類(lèi)患者均存在著 Dys陽(yáng)性表達(dá),勾畫(huà)出的肌細(xì)胞膜邊界提示肌纖維橫徑明顯縮小并粗細(xì)不一。

總之,DMD/BMD的臨床表型與肌細(xì)胞膜上 Dys表達(dá)的缺乏密切相關(guān),Dys表達(dá)的質(zhì)或量的改變是鑒別其臨床表型及判斷臨床預(yù)后的重要依據(jù)。免疫組化檢測(cè)骨骼肌肉組織 Dys的方法可用于復(fù)雜性DMD/BMD與不典型 FSHD、LGMD、神經(jīng)源性肌萎縮等疾病的鑒別。

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