鈣蛋白酶活性對顱腦創(chuàng)傷大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡和學習記憶的影響

劉清軍 張建寧 朱 軍 李建民

腦缺血后由于細胞內(nèi)鈣超載而激活calpain，激活后的calpain在缺血性腦損傷后神經(jīng)細胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用[1]。大量的研究表明顱腦損傷后神經(jīng)細胞內(nèi)存在著明顯的鈣超載[2]，但關于鈣蛋白酶在顱腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡過程中的作用少見報道。本研究通過觀察大鼠顱腦損傷后海馬鈣蛋白酶的活性對細胞凋亡以及學習功能的影響，進一步探討腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞凋亡和學習記憶功能障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 鈣蛋白酶抑制劑MDL 28170及溶血腦磷脂（lysocephalin）均為Sigma產(chǎn)品；TUNEL檢測試劑盒（武漢博士德公司）；酪蛋白，β－巰基乙醇為Serva產(chǎn)品；乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），二硫蘇糖醇（DTT）等其他試劑均為市售國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 實驗動物與分組 成年健康雄性SD大鼠120只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質(zhì)量350～400 g，隨機分為腦創(chuàng)傷組、治療組、假手術組及對照組，前3組各36只分為傷后6、12、24、48、72 h 5個時相組，每亞組6只，余6只進行Morris水迷宮測試；對照組12只，其中6只行calpain活性測定及凋亡檢測，另6只進行Morris水迷宮測試。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，麻醉后對治療組動物經(jīng)側(cè)腦室注射MDL 28170（10 μL），創(chuàng)傷組、假手術組及對照組按同樣方法給予生理鹽水（10 μL）。第2天復制動物模型。

1.3.2 大鼠重型閉合性顱腦損傷模型的制備 于致傷前0.5 h給大鼠經(jīng)腹腔注射阿托品（0．1 mg/只），用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，按照Marmarou等[3]的自由落體方法復制重型閉合性顱腦損傷模型。假手術組僅切開頭皮不致傷，對照組不做任何處理。各組在相應的時相點斷頭取腦，一側(cè)海馬組織進行calpain活性測定，另一側(cè)制作切片進行凋亡檢測；用于水迷宮測試的大鼠不處死。

1.3.3 calpain活性測定[4]取海馬組織加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（β－mercaptoethanol 5 mmol/L，EDTA 0.1 mmol/L，DTT 10 mmol/L，lysocephalin 5 mmol/L）在冰浴上用玻璃勻漿器將其制成組織勻漿，3 000 r/min離心10 min（4℃），取上清液置4℃冰箱待測calpain活性。每個樣品分成2管，總體積為200 μL，1管為無Ca2+體系，內(nèi)含酪蛋白0.4 mg、12 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EGTA及上清液40 μL；另1管除用1 mmol/L CaCl2代替EGTA外，余內(nèi)容物均相同。25℃反應30 min后依次向各管加入蒸餾水3.0 mL，考馬斯亮藍-G250染液（考馬斯亮藍-G250 0.05%，乙醇23.5%，磷酸42.5%）0.8 mL，充分混合10 min后于595 nm測吸光度（A）值。最后每個樣品的calpain酶活性用各相應的無鈣管A值減去有鈣管所得差值來計算。各管calpain活性以△A（/h·mg protein）表示。蛋白定量采用Lowry法。

1.3.4 凋亡檢測 嚴格按照德國BM公司（in situ cell death detection kit，AP）說明書操作，顯色液采用BCIP/NBT。每次實驗均設陰性對照，以PBS代替TUNEL標記反應混合液。凋亡陽性細胞核呈藍紫色。采用CMIAS2真彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學)和OLYMPUS攝像顯微鏡進行海馬CA2區(qū)錐體細胞層凋亡陽性細胞記數(shù)（個/400倍視野）。

1.3.5 Morris水迷宮測試 用于水迷宮測試的大鼠于傷后第7、8、9、10天進行定位航行能力測試。Morris水迷宮由圓形水池和安全島構(gòu)成，水池分為4個象限，安全島位于第4象限中央，由水迷宮圖像監(jiān)視系統(tǒng)自動跟蹤、拍攝和統(tǒng)計大鼠后尋找到安全島的潛伏期和軌跡。如在180 s內(nèi)未找到安全島，則潛伏期值記為180 s。每只大鼠每日測試1次，共測試4 d。每只大鼠入池位置在各象限邊1/2弧度頭朝池壁入水，每次入水的位置是隨機的。傷后第11天進行空間探索能力（即搜索站臺的軌跡）測試，在傷后第11天除去安全島，任選一入水點將大鼠放入水中，記錄大鼠3 min內(nèi)在池中搜索安全島的游泳軌跡。

2 結(jié)果

2.1 海馬鈣蛋白酶活性測定結(jié)果 創(chuàng)傷組大鼠海馬在傷后6 h鈣蛋白酶活性升高，于24 h達到高峰，72 h明顯下降。治療組較創(chuàng)傷組明顯下調(diào)（P＜0.05），見表1。對照組及假手術組大鼠各時相點未檢出海馬鈣蛋白酶活性。

表1 創(chuàng)傷組、治療組各時相點海馬鈣蛋白酶活性比較[n=6，△A/（h·mg protein）]

2.2 神經(jīng)細胞凋亡檢測結(jié)果 對照組及假手術組各時相點海馬區(qū)未見凋亡陽性細胞。創(chuàng)傷組大鼠傷后6 h海馬CA2區(qū)即出現(xiàn)少量凋亡陽性細胞，24 h明顯增多，72 h達高峰；治療組與創(chuàng)傷組同時相點比較，傷后12、24、48、72 h凋亡陽性細胞減少差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

2.3 定位航行能力測試結(jié)果 重復測量方差分析結(jié)果顯示F處理=9.352（P＜0.01），F(xiàn)時間=22.157（P＜0.01），F(xiàn)交互=1.551（P>0.05）。創(chuàng)傷組傷后8、9、10 d搜索安全島潛伏期較對照組及假手術組明顯延長。治療組傷后8、9、10 d搜索安全島潛伏期較創(chuàng)傷組明顯縮短，搜索軌跡較創(chuàng)傷組理想，見表3。

表2 創(chuàng)傷組、治療組各時相點海馬CA2區(qū)神經(jīng)細胞凋亡比較 （n=6，個/400倍視野±s）

表2 創(chuàng)傷組、治療組各時相點海馬CA2區(qū)神經(jīng)細胞凋亡比較 （n=6，個/400倍視野±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

創(chuàng)傷組治療組t時相組別12 h 11.12±2.45 7.78±1.56 2.817*24 h 17.67±3.97 9.75±1.47 4.583**48 h 21.43±4.13 13.46±2.03 4.242**72 h 27.89±5.16 15.52±2.61 5.240**6 h 5.34±0.87 4.78±0.86 1.121

表3 各組定位航行能力測試結(jié)果 （n=6，s，±s）

表3 各組定位航行能力測試結(jié)果 （n=6，s，±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

對照組（1）假手術組（2）創(chuàng)傷組（3）治療組（4）q 1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4 7 d 175.24±31.65 174.98±32.12 177.14±35.27 175.75±37.38 8 d 119.97±21.15 120.55±22.76 167.27±27.91 132.24±21.67 0.046 4.925*1.278*4.864**0.911 3.647*9 d 49.76±10.43 50.19±11.13 143.57±21.38 75.89±14.56 0.070 15.304**4.263*15.234**4.193**11.041**10 d 20.23±4.13 22.09±4.22 82.89±13.63 39.43±7.22 0.552 18.586**5.695**18.035**5.143**12.891**時相組別

2.4 空間探索能力測試結(jié)果 對照組、假手術組、創(chuàng)傷組及治療組第4象限的航行時間分別為（142.49±23.68）s、（140.24±21.45）s、（63.72±10.79）s及（101.38±19.46）s，差異有統(tǒng)計學意義（F=22.01，P<0.01），創(chuàng)傷組較對照組明顯縮短（q=9.911，P<0.01），治療組較創(chuàng)傷組明顯延長（q=4.739，P<0.05）。

3 討論

calpain屬于半胱氨酸蛋白酶中番木瓜蛋白酶家族成員，根據(jù)對鈣離子敏感性的不同可分為m型和μ型。calpain廣泛分布于哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的胞質(zhì)、質(zhì)膜和其他細胞器膜中，正常情況下以無活性的酶原形式存在。該酶不僅參與細胞內(nèi)正常的信號轉(zhuǎn)錄，而且參與許多病理過程，包括顱腦損傷、腦缺血等神經(jīng)元退變[1,5]。以往一直認為鈣蛋白酶只引起神經(jīng)元壞死，而最近的研究表明鈣蛋白酶在腦損傷后神經(jīng)元凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用[6]。大量的研究已經(jīng)證實顱腦損傷后存在神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載，從而使鈣蛋白酶激活，導致對細胞蛋白的選擇性分解，如細胞骨架蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，還有涉及信號傳遞的酶類如PKC等，對細胞蛋白的分解可以正反饋調(diào)節(jié)細胞質(zhì)的Ca2+內(nèi)流量。細胞質(zhì)Ca2+內(nèi)流量的增加和被激活的相關涉及信號傳遞的酶類，均最終激活Caspase途徑產(chǎn)生級聯(lián)反應，從而導致細胞凋亡[7]。大量的研究已經(jīng)證實Caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行過程的關鍵蛋白酶。Blomgren等[8]利用腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3的激活可被鈣蛋白酶抑制劑CX295顯著抑制，而CX295對Caspase-3本身并無抑制作用，說明Caspase-3的激活與鈣蛋白酶有關。已有學者研究證實顱腦損傷后不僅出現(xiàn)calpain的激活，同時還伴有calpain表達增加[9]。本研究顯示大鼠顱腦損傷后海馬區(qū)在傷后6 h鈣蛋白酶活性升高，于24 h達到高峰，其高峰先于傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡的高峰，說明calpain的激活可能在顱腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮重要作用。

鈣蛋白酶抑制劑MDL 28170是人工合成的肽類鈣蛋白酶抑制劑，具有高效性、特異性及較好的膜穿透性等優(yōu)點。有學者利用液壓打擊模型研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑MDL 28170能夠有效地保護腦損傷后胼胝體的結(jié)構(gòu)和功能[10]。新近有研究證實椎管內(nèi)注射鈣蛋白酶抑制劑MDL 28170能夠有效地保護脊髓損傷后脊髓的結(jié)構(gòu)和功能[11]。學習記憶是人類賴以生存不可缺少的重要的腦功能之一，海馬是記憶儲存的關鍵結(jié)構(gòu)。近年來，分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，海馬作為腦損傷后選擇易損區(qū)，傷后出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡，從而出現(xiàn)長期學習記憶功能障礙[12]。本研究中，傷前1 d經(jīng)側(cè)腦室注射MDL 28170（10 μL）能夠有效地使傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡的高峰明顯下調(diào)，同時學習記憶功能亦顯著改善。該結(jié)果進一步提示，calpain的激活可能參與了顱腦損傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡和學習記憶功能障礙的過程，鈣蛋白酶抑制劑可能是治療顱腦損傷的有效藥物。

[1]Ray SK.Currently evaluated calpain and caspase inhibitors for neuroprotection in experimental brain ischemia[J].Curr Med Chem,2006,13(28):3425-3440.

[2]Wojda U,Salinska E,Kuznicki J.Calcium ions in neuronal degeneration.IUBMB Life,2008,60(9):575-590.Review.

[3]Marmarrou A,Foda MA,Vav-den-Brink W,et al.A new model of diffuse brain injury in rats.Part I:Pathophysiology and biomechanics.J Neurosurg,1994,80(2):291-300.

[4]Buroker-Kilgore M,Wang KK.A coomassie brilliant blue G-250-based colorimetric assay for measuring activity of calpain and other proteases[J].Anal Biochem,1993,208(2):387-392.

[5]Zhao X,Newcomb JK,Pike BR,et al.Casein zymogram assessment of mu-calpain and m-calpain activity after traumatic brain injury in the rat in vivo[J].Methods Mol Biol,2000,144(2):117-120.

[6]Soustiel JF,Vlodavsky E,Zaaroor M.Relative effects of mannitol and hypertonic saline on calpain activity,apoptosis and polymorphonuclear infiltration in traumatic focal brain injury.Brain Res,2006,1101(1):136-144.

[7]Saatman KE,Abai B,Grosvenor A,et al.Traumatic axonal injury results in biphasic calpain activation and retrograde transport impairment in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(1):34-42.

[8]Blomgren K,Zhu C,Wang X,et al.Synergistic activation of caspase-3 by m-calpain after neonatal hypoxia-ischemia:a mechanism of pathological apoptosis[J].J Biol Chem,2001,276(13):10191-10198.

[9]Liu MC,Akle V,Zheng W,et al.Comparing calpain-and caspase-3-mediated degradation patterns in traumatic brain injury by differential proteome analysis[J].Biochem J,2006,394(3):715-725.

[10]Ai J,Liu E,Wang J,et al.Calpain inhibitor MDL-28170 reduces the functional and structural deterioration of corpus callosum following fluid percussion injury[J].J Neurotrauma,2007,24(6):960-978.

[11]Yu CG,Joshi A,Geddes JW.Intraspinal MDL28170 microinjection improves functional and pathological outcome following spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2008,25(7):833-840.

[12]Zhou Z,Sun D,Levasseur JE,et al.Perfluorocarbon emulsions improve cognitive recovery after lateral fluid percussion brain injury in rats[J].Neurosurgery,2008,63(4):799-807.