李 晶 趙 鋼

抗纖復(fù)方是臨床治療肝纖維化的有效藥物，由黃芪、丹參、紫河車、郁金等藥物組成[1]。以往的實驗研究表明，該藥不僅能夠抑制肝內(nèi)多種細(xì)胞外基質(zhì)的合成，而且能夠抑制肝纖維化大鼠肝星形細(xì)胞TGFβ1的表達(dá)，減少膠原產(chǎn)生[2，3]。我們?yōu)榱搜芯吭搹?fù)合方劑抗肝纖維化作用機(jī)制，以不同劑量抗纖復(fù)方含藥血清進(jìn)行實驗室研究，以Northern 印跡雜交方法進(jìn)一步觀察抗纖復(fù)方對HSC-LI90細(xì)胞I型（CoL-I）、IV型前膠原（CoL-IV）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 抗纖復(fù)方的制備

其無菌制劑由上海曙光醫(yī)院制劑中心制備，以蒸餾水分別稀釋成0.025、0.05、0.10、0.3g/mL等不同濃度。

1.2 細(xì)胞系

星形細(xì)胞系HSC-LI90由日本佐賀醫(yī)科大學(xué)肝病中心惠贈，系表型為活化的人肝星形細(xì)胞（HSC），表達(dá)高水平的CoL-I、MMP-II、TIMP-l、TGFβ1mRNA等[4]。

1.3 動物

用于制備含藥血清的大鼠，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量300～350g，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.4 抗纖復(fù)方含藥血清的制備

大鼠隨機(jī)分為5組，每組5只，其中4組按體質(zhì)量灌胃給予抗纖復(fù)方水溶液1.0mL/100g體質(zhì)量，2次/d，劑量依次為0．5、2.0體質(zhì)量、4.0g/kg體質(zhì)量，于給藥后90min分別以1.5%的苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下，從腹主動脈采血約10mL，存放于4℃冰箱中，待血漿凝固血清析出后，于高速離心機(jī)中以3000rpm離心10min，留取血清。另設(shè)一組作為空白對照組。所有血清均經(jīng)56℃、30min滅活后，置-20%冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

HSC-LI90細(xì)胞以1×106細(xì)胞/100mm的濃度接種于培養(yǎng)皿，24h后，分別加入10%抗纖復(fù)方含藥血清10mL，同時設(shè)空白對照組。培養(yǎng)48h后，提取細(xì)胞總RNA，檢測HSC-LI90細(xì)胞I型、IV型前膠原、TIMP-1mRNA表達(dá)。

1.6 CoL-I 、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的Northern印跡雜交

運(yùn)用AGPC法，從HSC-LI90細(xì)胞中提取總RNA。每20μg總RNA加入1%瓊脂糖凝膠中，電泳后，將變性的RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜（AmershamJapan）然后用32P-dCTP標(biāo)記的cDNA探針與之雜交16h，雜交濃度65℃，洗膜2次以后，放射自顯影。定量用BAS2000測定分析。用CoL-I（CoL-III、TIMP-1）/GAPDH的比值表示CoL-I、CoL-III、TIMP-1表達(dá)水平。每項實驗至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用mean±SD表示，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié) 果

不同濃度的抗纖復(fù)方含藥血清均有降低CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA水平的作用，并呈一定劑量依存關(guān)系，統(tǒng)計學(xué)處理P＜0.05或0.01，結(jié)果見圖1。

圖1 抗纖復(fù)方含藥血清CoL-I、CoL-IV 、TIMP-1 mRNA的影響

3 討 論

肝纖維化為諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組織學(xué)變化，是影響肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)，在尚無有效方法根治原發(fā)疾病的情況下，減緩或阻止肝纖維化的進(jìn)程，是相當(dāng)重要的治療對策。 肝纖維化、肝硬化的病理基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟異常的沉積，這種異常的沉積，和（或）膠原合成、降解的動態(tài)平衡失調(diào)有關(guān)。研究肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及其治療對策時，應(yīng)對細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解兩方面同時加以觀察，凡是能夠影響膠原合成及/或膠原降解代謝的手段，都是阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化和肝硬化的有效方法[5]。

肝星形細(xì)胞是ECM的主要來源，肝星形細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細(xì)胞，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細(xì)胞，正常情況下，肝星形細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時，肝星形細(xì)胞被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?。激活的肝星形?xì)胞一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高。肝星形細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝（HSC）是肝臟間質(zhì)細(xì)胞之一，是肝纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過多產(chǎn)生和沉積的主要細(xì)胞來源[6]。針對HSC活化的不同環(huán)節(jié)進(jìn)行抗肝纖維化治療已形成了共識，如果能夠抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成和（或）促進(jìn)ECM的降解，則有可能緩解、阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化、早期肝硬化。

肝星形細(xì)胞HSC-LI90系表型為活化的人星形細(xì)胞，表達(dá)高水平的CoL-I、MMP-2、TIMP-1 mRNA等，HSC-LI90是體外研究肝纖維化發(fā)生機(jī)制、觀察抗肝纖維化藥物作用的較為理想的模型[4]。我們采用中藥組方抗纖復(fù)方取其不同濃度的含藥血清觀察了其對HSC-LI90細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響。

Ⅰ型、Ⅳ型膠原是纖維化時病變部位沉積的主要膠原蛋白，Ⅵ型膠原是肝基底膜的主要成分，肝纖維化時含量明顯增高，血中Ⅵ型膠原的水平與肝纖維化程度成正相關(guān)。在實驗性肝纖維化模型中，Ⅰ型、Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致其產(chǎn)物過度沉積，Ⅰ型、IV型膠原mRNA在一定程度上可以反映ECM的沉積。我們實驗結(jié)果表明，抗纖復(fù)方可明顯降低HSC-LI90細(xì)胞I型、Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)水平，從而減少膠原的沉積。

TIMP-1是一種糖蛋白，是ECM主要結(jié)構(gòu)蛋白降解特異酶MMPS的抑制劑，肝纖維化時間質(zhì)膠原酶活性下降而TIMP-1的表達(dá)增加，且與PⅢP、LN正相關(guān)，與肝纖維化程度相關(guān)。其主要作用是抑制MMP酶原的活化及其對ECM的降解，血清TIMP-1水平反映了慢性肝病肝內(nèi)炎癥和纖維化的一些重要特征，在目前情況下，是一種肝纖維化無創(chuàng)診斷和隨訪指標(biāo)。TIMP-1是抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的一組多功能因子家族的主要成員之一，能結(jié)合除14、19以外的所有MMPs而使其活性減弱，是肝纖維化發(fā)生過程中的一個非常重要的促發(fā)因素。許多實驗研究表明，肝損傷激活HSC，表達(dá)MMPs和TIMPs，在肝損傷早期階段，體外培養(yǎng)的HSC一過性表達(dá)MMP3、MMP13等，之后，HSC表型發(fā)生變化，前MMP2和MT-MMP表達(dá)，MMP2活化，降解局部正常的肝臟基質(zhì)；并且TIMP-1表達(dá)明顯，抑制間質(zhì)膠原酶（MMP1/MMP13）對膠原的降解。而在肝損傷停止后，TIMP-1迅速減少，膠原酶活性增加，降解ECM，纖維化逆轉(zhuǎn)[7]。可以證明，TIMP-1在調(diào)節(jié)膠原的降解代謝中發(fā)揮著重要的作用。通過研究我們認(rèn)為不同濃度抗纖復(fù)方含藥血清作用HSC-LI90細(xì)胞48h后0.5、2.0、4.0g/kg含藥血清有降低 TIMP-1 mRNA水平的作用，提示抗纖復(fù)方具有促進(jìn)膠原降解的作用。

抗纖復(fù)方可明顯降低HSC-LI90細(xì)胞CoL-I、CoL-IV、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平，從而干預(yù)肝纖維化及肝硬化時的膠原合成、降解代謝，發(fā)揮其抗肝纖維化的作用。

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[2]張斌,王靈臺,陳建杰.抗纖復(fù)方影響大鼠肝貯脂細(xì)胞生成I、III型膠原的比較研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2000,6:33-35.

[3]王靈臺,張斌,陳建杰.抗纖復(fù)方藥物血清對肝纖維化大鼠肝細(xì)胞生成膠原的影響[J].中華消化雜志,1999,19:391-393.

[4]Ozaki I, Zhao G.Hepatocyte growth factor induces collagenase via the transcription factor Ets-1 in human hepatic stellatc cell line[J].J Hepatol,2002,36:169-178.

[5]王寶恩.肝纖維化[J].中華肝臟病雜志,2000,8(4):179.

[6]王寶恩.肝纖維化時細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解[J].中華肝臟病雜志,1997,5(2):65.

[7]Benyon RC,Arthur MJ.Extracellular matrix degradation and the role of hepatic stellate cell[J].Semin Liver Dis,2001,21(3):373.