危曉莉 王 媚 潘佩蕾 陳麗芬 (浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,杭州310058)

許多中藥及中藥復(fù)方可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或具有細(xì)胞因子樣作用,且能增加免疫細(xì)胞活性,故可用于腫瘤的生物治療。本課題研究了小檗堿(Berberine,Ber)對(duì)外周血來(lái)源DC和CIK增殖和殺HepG-2活性的影響,探討小檗堿應(yīng)用于腫瘤過(guò)繼免疫治療的潛能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD3McAb(美國(guó)eBioscience公司);rhIL-1β、rhIL-2、rhIL-4、rhGM-CSF 、rhIFN-γ(美國(guó) PEPROTECH公司);MTT、小檗堿(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備HepG-2腫瘤細(xì)胞凍融物抗原 消化、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞,PBS調(diào)整濃度為4×107ml-1,反復(fù)凍融3次,離心取上清,過(guò)濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 人外周血來(lái)源DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) Ficoll密度梯度離心法分離無(wú)菌肝素抗凝外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),細(xì)胞培養(yǎng)板孵育2小時(shí)后,懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增CIK,貼壁的單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成DC,DC培養(yǎng)液中rhIL-4(500 U/ml)、rhGM-CSF(1 000 U/ml)。48小時(shí)后DC分為兩組,一組加入小檗堿3μmol/L,另一組為陰性對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后,兩組均加入HepG-2腫瘤細(xì)胞凍融物抗原20μg/ml。

1.2.3 IL-12檢測(cè) 培養(yǎng)第8天收集兩組DC上清,ELISA法檢測(cè)IL-12水平。

1.2.4 CIK體外誘導(dǎo)擴(kuò)增 上述懸浮細(xì)胞加入IFN-γ1 000 U/ml,37℃,5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)后加入IL-1 10U/ml、CD3McAb 50 ng/ml、IL-2 300U/m1,每 3天半量換液1次。

1.2.5 DC和CIK共培養(yǎng) 第8天分別收集兩組DC和CIK,計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度,按DC∶CIK 為1∶5和1∶10混合共培養(yǎng),每3天補(bǔ)充IL-2 300 U/ml,第15天收集各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.6 DC-CIK對(duì)HepG-2殺傷活性檢測(cè) 收集培養(yǎng)第15天各組DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG-2肝癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞,按DC-CIK 與HepG-2效靶比分別為5∶1,10∶1,20∶1混合,另設(shè)DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照和HepG-2靶細(xì)胞對(duì)照,均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃,5%CO2孵育12小時(shí),MTT法檢測(cè)各孔OD值并計(jì)算殺傷率,殺傷率(%)=[1-

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Stata7.0軟件,進(jìn)行自身配對(duì)t檢驗(yàn)及方差分析,P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)第8天,鏡下觀察小檗堿組DC較陰性對(duì)照組DC長(zhǎng)勢(shì)好,大部分細(xì)胞懸浮不貼壁,聚集成簇,為細(xì)胞集落,平均每個(gè)視野細(xì)胞集落明顯多且大,細(xì)胞胞體較大,見(jiàn)毛刺狀突起,形態(tài)不規(guī)則。

2.2 小檗堿對(duì)DC、DC-CIK細(xì)胞增殖能力的影響血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)第8天小檗堿組與陰性對(duì)照組DC,結(jié)果顯示:小檗堿組DC較陰性對(duì)照組明顯增多,P＜0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)見(jiàn)DC與較多CIK細(xì)胞聚集成團(tuán),培養(yǎng)第15天見(jiàn)DC-CIK細(xì)胞群增殖迅速,成團(tuán)塊狀生長(zhǎng),大小均一。兩組 DC-CIK計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:DC∶CIK=1∶5時(shí),小檗堿組DC-CIK 增殖能力明顯高于陰性對(duì)照組,P＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,DC∶CIK=1∶10時(shí),小檗堿組DC-CIK增殖能力高于陰性對(duì)照組,但P＞0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 小檗堿對(duì)DC產(chǎn)生IL-12能力的影響 DC培養(yǎng)上清中IL-12含量小檗堿組為27.37±8.09 pg/ml,陰性對(duì)照組為30.83±11.24 pg/ml,兩組相比 P＞0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 小檗堿組和陰性對(duì)照組DC-CIK對(duì)HepG-2殺傷活性的比較 當(dāng)DC與CIK同一混合比例,DCCIK與HepG-2同一效靶比時(shí),小檗堿組和陰性對(duì)照組的殺傷率比較P＞0.05;當(dāng)DC與CIK不同混合比例而DC-CIK與HepG-2同一效靶比時(shí),小檗堿組和陰性對(duì)照組的殺傷率比較P＞0.05,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;每組組內(nèi)隨著效靶比的增高殺傷率增高,其中DC∶CIK為1∶5時(shí)小檗堿組殺傷率和DC∶CIK為1∶10時(shí)陰性對(duì)照組殺傷率組內(nèi)比較P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其差異均主要是來(lái)自于效靶比為5∶1和20∶1時(shí)的差異(表2)。

表1 小檗堿組與陰性對(duì)照組的 DC和CIK增殖能力的比較(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

表1 小檗堿組與陰性對(duì)照組的 DC和CIK增殖能力的比較(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

Note:1)Compared with negative control group P＜0.01;2)Comparedwith negative control group P＜0.05.

Groups DC DC-CIK DC∶CIK=1∶5 DC∶CIK=1∶10 Berberine group 3.785±2.0961) 8.142±2.9092) 12.358±6.367 Negative control group 2.684±1.496 5.900±1.96 9.375±2.420

表2 小檗堿組和陰性對(duì)照組 DC-CIK對(duì) HepG-2的殺傷活性及比較(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

表2 小檗堿組和陰性對(duì)照組 DC-CIK對(duì) HepG-2的殺傷活性及比較(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

Note:1)As the ratio of DC∶CIK is 1∶5,the killing rateis compared among the Berberinegroup,P ＜0.05;2)As the ratio of DC∶CIK is 1∶10,the killing rate is compared among the negative control group,P＜0.05.

Groups DC∶CIK=1∶5DC∶CIK=1∶10 5∶1 10∶1 20∶15∶1 10∶1 20∶1 Berberine Group 63.0±11.91) 70.4±11.8 80.9±9.1 62.8±10.1 72.2±11.8 73.9±8.3 Negative Control group 68.8±11.0 69.0±12.0 72.8±10.9 65.7±5.82) 73.4±10.4 78.5±9.3

3 討論

DC聯(lián)合CIK治療腫瘤在體內(nèi)外試驗(yàn)中均顯示出強(qiáng)大的殺傷活性和眾多的優(yōu)勢(shì)[1,2],但其突出的缺點(diǎn)是成本高,特別是制備所需的細(xì)胞因子價(jià)格昂貴,極大的限制了其臨床應(yīng)用率。有些學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)向外源性物質(zhì)誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞因子產(chǎn)生,進(jìn)而取代輸入外來(lái)重組品的思路上來(lái)。實(shí)驗(yàn)與臨床研究證實(shí),許多中藥及中藥復(fù)方可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或具有細(xì)胞因子樣作用,可減少細(xì)胞因子用量,且能增加免疫細(xì)胞活性,故對(duì)于腫瘤的治療,包括直接的抗腫瘤治療和過(guò)繼免疫治療都是十分有利的[3-5]。小檗堿是一味古老抗菌藥,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)一些腫瘤有直接抗腫瘤作用[6],其是否具有間接抗腫瘤作用呢?Kang等[7]實(shí)驗(yàn)證明小檗堿可以增加LPS激活的巨噬細(xì)胞IL-12、IFN-γ表達(dá),可抑制抗原刺激的CD4+T細(xì)胞分泌IL-4,且使CD4+T細(xì)胞偏離Th2而向Th1分化,這為小檗堿用于抗微生物和抗腫瘤作用提供了新的解釋。本實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)7天后小檗堿組細(xì)胞數(shù)比陰性對(duì)照組高出1.5倍左右,形態(tài)更成熟,DC與CIK共培養(yǎng)時(shí),小檗堿組DC-CIK細(xì)胞比陰性對(duì)照組多,說(shuō)明小檗堿能促進(jìn)DC的增殖,能增強(qiáng)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力。而DC分泌IL-12水平兩組沒(méi)有明顯差別,說(shuō)明小檗堿促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的能力不是通過(guò)提高IL-12分泌水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的 ,當(dāng)然是否通過(guò)促進(jìn) DC 分泌 IFN-γ、IL-1、IL-2,即CIK誘導(dǎo)細(xì)胞因子,來(lái)促進(jìn)CIK的增殖還有待進(jìn)一步研究。小檗堿對(duì)DC-CIK殺HepG-2活性無(wú)明顯影響,表明小檗堿不影響DC-CIK殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。綜上所述,小檗堿能促進(jìn)DC和DC-CIK的增殖,對(duì)DC-CIK單細(xì)胞殺腫瘤活性沒(méi)有影響,其促進(jìn)DC和DC-CIK增殖的機(jī)制可能是因?yàn)樾￠迚A具有類細(xì)胞因子的作用,但也可能有其他作用機(jī)制的影響,還有待于進(jìn)一步的研究。鑒于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可初步認(rèn)為小檗堿有可能用于臨床DC-CIK的過(guò)繼免疫治療,對(duì)降低CIK的制備成本,提高DC-CIK臨床應(yīng)用率有重要意義。

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