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      小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子及脂肪酸代謝的影響*

      2014-06-15 18:35:22岳晶晶牛文彥
      天津醫(yī)藥 2014年6期
      關(guān)鍵詞:堿組內(nèi)脂小檗

      李 萍 岳晶晶 張 達(dá) 牛文彥 何 慶△

      細(xì)胞與分子生物學(xué)

      小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子及脂肪酸代謝的影響*

      李 萍1岳晶晶2張 達(dá)3牛文彥3何 慶1△

      目的 觀察小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子及脂肪酸代謝的影響,探討小檗堿改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。方法3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度小檗堿(0、5、10、20和40 μmol/L)處理24 h后,采用qRTPCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平,包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、瘦素、脂聯(lián)素和內(nèi)脂素以及脂肪酸合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪組織甘油三酯水解酶(ATGL)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)。同時(shí)用10 μmol/L小檗堿分別處理脂肪細(xì)胞0、4、8、24、48 h后,以相同方法測(cè)定上述指標(biāo)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果10~40 μmol/L小檗堿劑量組的脂肪細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α、瘦素、FAS、ATGL、AFABP mRNA表達(dá)水平均低于0 μmol/L組,內(nèi)脂素mRNA高于0 μmol/L組(P<0.05),各組間脂聯(lián)素mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。8~48 h時(shí)間處理組細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α、瘦素、AFABP、ATGL、FAS mRNA表達(dá)水平均低于0 h組,內(nèi)脂素mRNA水平高于0 h組(P<0.05)。脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平僅在48 h處理組降低(P<0.05)。各組間ACC mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論小檗堿能影響3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子和關(guān)鍵脂肪酶及蛋白mRNA的表達(dá),且呈時(shí)間、劑量依賴效應(yīng),這可能是其改善胰島素抵抗的重要分子機(jī)制。

      小檗堿;胰島素抵抗;白細(xì)胞介素-6;腫瘤壞死因子α;瘦素;脂聯(lián)素;內(nèi)脂素;乙酰CoA羧化酶;脂肪酸合酶;脂肪組織甘油三酯水解酶;脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白;基因表達(dá)

      近年來(lái),2型糖尿病炎癥學(xué)說(shuō)備受關(guān)注,不少學(xué)者認(rèn)為糖尿病是一種慢性低度炎癥性疾病[1],其中脂肪組織可能扮演著重要角色。脂肪組織被認(rèn)為是活躍的內(nèi)分泌免疫器官,其能夠通過(guò)影響脂肪因子及炎癥因子的表達(dá),導(dǎo)致胰島素抵抗[2]。小檗堿作為傳統(tǒng)中藥黃連的主要成分,具有降糖、降脂及改善胰島素敏感性等作用[3],尤其在脂肪組織中發(fā)揮的作用備受關(guān)注。本研究旨在觀察小檗堿對(duì)脂肪細(xì)胞的脂肪因子、炎癥因子及脂肪酸代謝關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響,探討小檗堿改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 材料和試劑 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株由加拿大Amira Klip教授惠贈(zèng);小檗堿、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自以色列Bioind公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限責(zé)任公司;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生物科技公司;Hanks液購(gòu)自天津圣東生物科技發(fā)展有限公司。高純總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、Premix ExTaq酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture購(gòu)自Takara寶生物工程(大連)有限公司;SYBR Green購(gòu)自瑞士羅氏公司。

      1.2 方法

      1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)與分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞株用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí),將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿2 d后,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基及含0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素的分化液,培養(yǎng)48 h,再以含10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,然后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每隔2 d換液1次,誘導(dǎo)分化8~12 d后,待90%以上的3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型再進(jìn)行下一步處理。

      1.2.2 分組及處理 將小檗堿溶于二甲基亞砜(DMSO)中,配成終濃度為0.04 mol/L的溶液。(1)按小檗堿劑量分組:0(對(duì)照組)、5、10、20和40 μmol/L的小檗堿劑量組,處理3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞備用,同時(shí)設(shè)立空白組(未加DMSO)。(2)按小檗堿作用時(shí)間分組:6孔板中分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L小檗堿分別處理0(對(duì)照組)、4、8、24、48 h后,收集細(xì)胞備用,同時(shí)設(shè)立空白組(未加DMSO)。

      1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子表達(dá)水平 包括炎癥因子[白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α]、脂肪因子(瘦素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素)及脂肪酸代謝相關(guān)酶或蛋白[脂肪酸合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪組織甘油三酯水解酶(ATGL)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)]。使用TRIzol法分別提取上述各組脂肪細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后行qRT-PCR擴(kuò)增,引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系(25 μL):SYBR Green12.5 μL,Rnase-free水10 μL,上、下游引物各0.75 μL,cDNA工作液1 μL。95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火/延伸30 s,循環(huán)45個(gè)周期,95℃變性15 s,60℃退火/延伸1 min,95℃變性15 s,60℃退火/延伸15 s。每次延伸步驟結(jié)束后,通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度,來(lái)定量檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

      Table 1 Gene primer sequences used for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,定量指標(biāo)采用±s描述平均水平,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD-t),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 不同劑量組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子及脂肪酸代謝的影響 (1)炎癥因子、脂肪因子。10~40 μmol/L小檗堿組的IL-6、TNF-α、瘦素mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組,內(nèi)脂素mRNA水平高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組與空白組的IL-6、TNF-α、瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間脂聯(lián)素mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。(2)脂肪酸代謝。10~40 μmol/L小檗堿組的FAS、ATGL、AFABP mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05),以20 μmol/L劑量組變化最明顯,對(duì)照組與空白組的FAS、ATGL、AFABP mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組ACC mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表3。

      Table 2 Effects of different concentrations of berberine on inflammatory factors and adipokines mRNA in 3T3-L1 adipocytes表2 不同劑量組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子mRNA的影響 (n=3,±s)

      Table 2 Effects of different concentrations of berberine on inflammatory factors and adipokines mRNA in 3T3-L1 adipocytes表2 不同劑量組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子mRNA的影響 (n=3,±s)

      *P<0.05;a與對(duì)照組比較,P<0.05;表3~5同

      組別空白組對(duì)照組5 μmol/L小檗堿組10 μmol/L小檗堿組20 μmol/L小檗堿組40 μmol/L小檗堿組F IL-6 1.000±0.000 1.013±0.060 0.367±0.055a0.246±0.089a0.242±0.076a0.285±0.050a111.505*TNF-α 1.000±0.000 1.025±0.126 0.558±0.074a0.387±0.066a0.288±0.061a0.330±0.054a61.819*組別空白組對(duì)照組5 μmol/L小檗堿組10 μmol/L小檗堿組20 μmol/L小檗堿組40 μmol/L小檗堿組F瘦素1.000±0.000 1.073±0.035 0.573±0.062a0.351±0.097a0.133±0.029a0.166±0.035a181.846*脂聯(lián)素1.000±0.000 0.963±0.126 0.792±0.074 0.940±0.066 0.785±0.061 0.846±0.054 0.399內(nèi)脂素1.000±0.000 1.053±0.056 1.082±0.075 1.382±0.012a1.725±0.032a1.681±0.036a170.723*

      Table 3 Effects of different concentrations of berberine on fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes表3 不同劑量組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響 (n=3,ˉ±s)

      Table 3 Effects of different concentrations of berberine on fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes表3 不同劑量組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響 (n=3,ˉ±s)

      組別空白組對(duì)照組5 μmol/L小檗堿組10 μmol/L小檗堿組20 μmol/L小檗堿組40 μmol/L小檗堿組F FAS mRNA 1.000±0.000 0.930±0.058 0.537±0.096a0.381±0.067a0.202±0.018a0.270±0.036a73.369*ACC mRNA 1.000±0.000 1.019±0.055 1.030±0.083 1.091±0.067 1.008±0.127 1.033±0.096 0.129組別空白組對(duì)照組5 μmol/L小檗堿組10 μmol/L小檗堿組20 μmol/L小檗堿組40 μmol/L小檗堿組F ATGL mRNA 1.000±0.000 1.004±0.118 0.682±0.095a0.650±0.059a0.348±0.068a0.387±0.094a14.834*AFABP mRNA 1.000±0.000 1.039±0.014 0.909±0.012 0.810±0.042a0.668±0.122a0.717±0.080a11.693*

      2.2 不同時(shí)點(diǎn)組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子及脂肪酸代謝的影響 (1)炎癥因子、脂肪因子。小檗堿處理4~48 h組的IL-6、TNF-α、瘦素mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組,以48 h處理組降低最明顯(P<0.05)。小檗堿處理8~48 h組的內(nèi)脂素mRNA水平高于對(duì)照組,以24 h處理組升高最明顯(P<0.05)。小檗堿處理48 h組的脂聯(lián)素mRNA低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組與空白組的各因子表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表4。(2)脂肪酸代謝。不同時(shí)點(diǎn)小檗堿組的AFABP mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均降低,F(xiàn)AS、ATGL mRNA水平分別在24 h、8 h開(kāi)始降低(P<0.05),三者最大抑制效應(yīng)均出現(xiàn)在48 h處理組。各組間ACC mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組與空白組的各因子表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表5。

      Table 4 Effects of different durations of berberine on inflammatory factors,adipokines mRNA in 3T3-L1 adipocytes表4 不同時(shí)點(diǎn)組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子mRNA的影響 (n=3,ˉ±s)

      Table 4 Effects of different durations of berberine on inflammatory factors,adipokines mRNA in 3T3-L1 adipocytes表4 不同時(shí)點(diǎn)組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子、脂肪因子mRNA的影響 (n=3,ˉ±s)

      組別空白組對(duì)照組4 h小檗堿組8 h小檗堿組24 h小檗堿組48 h小檗堿組F IL-6 1.000±0.000 1.023±0.031 0.784±0.074a0.767±0.087a0.592±0.031a0.345±0.054a65.528*TNF-α 1.000±0.000 1.005±0.058 0.704±0.089a0.342±0.001a0.326±0.090a0.287±0.004a106.767*組別空白組對(duì)照組4 h小檗堿組8 h小檗堿組24 h小檗堿組48 h小檗堿組F瘦素1.000±0.000 1.010±0.051 0.821±0.021a0.797±0.057a0.624±0.071a0.476±0.096a39.065*脂聯(lián)素1.000±0.000 0.991±0.077 0.968±0.132 0.930±0.113 0.897±0.156 0.658±0.087a4.323*內(nèi)脂素1.000±0.000 1.084±0.105 0.978±0.071 1.560±0.036a1.660±0.151a1.451±0.071a23.451*

      3 討論

      小檗堿傳統(tǒng)上作為抗菌和止瀉藥物應(yīng)用于臨床。最近,有研究發(fā)現(xiàn)它還有降糖、降脂、抗炎、抗癌及改善抑郁癥等作用[4]。藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可在脂肪組織中發(fā)揮降糖作用,但具體通過(guò)影響哪些因子發(fā)揮降糖作用,尚不明確[5]。

      Table 5 Effects of different durations of berberine on fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes表5 不同時(shí)點(diǎn)組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響 (n=3,ˉ±s)

      Table 5 Effects of different durations of berberine on fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes表5 不同時(shí)點(diǎn)組小檗堿對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝的影響 (n=3,ˉ±s)

      組別空白組對(duì)照組4 h小檗堿組8 h小檗堿組24 h小檗堿組48 h小檗堿組F FAS mRNA 1.000±0.000 1.040±0.092 0.867±0.124 0.966±0.043 0.330±0.017a0.056±0.011a78.526*ACC mRNA 1.000±0.000 1.089±0.061 1.057±0.073 1.078±0.087 1.107±0.050 0.929±0.073 2.197組別空白組對(duì)照組4 h小檗堿組8 h小檗堿組24 h小檗堿組48 h小檗堿組F ATGL mRNA 1.000±0.000 0.981±0.070 0.922±0.115 0.805±0.053a0.690±0.075a0.433±0.024a20.761*AFABP mRNA 1.000±0.000 1.100±0.099 0.810±0.062a0.822±0.119a0.747±0.097a0.519±0.023a13.096*

      近年來(lái),慢性炎癥與胰島素抵抗的相關(guān)性已經(jīng)逐漸得到學(xué)術(shù)界共識(shí)。炎癥因子(IL-6、TNF-α)、脂肪因子(瘦素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素等)可能參與或加重肥胖、胰島素抵抗的發(fā)生[6]。本研究以10 μmol/L小檗堿干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),IL-6、TNF-α、瘦素mRNA表達(dá)水平明顯降低,內(nèi)脂素mRNA表達(dá)水平明顯升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道[5]基本一致。且當(dāng)小檗堿作用時(shí)間為24 h時(shí),以20 μmol/L劑量組效應(yīng)最顯著。提示小檗堿在轉(zhuǎn)錄水平能有效抗炎及調(diào)節(jié)脂肪因子的表達(dá),并存在一定的劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L小檗堿在處理48 h后,脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素mRNA水平反而低于24 h,與谷衛(wèi)等[7]的結(jié)果截然相反,可能與小檗堿抑制總脂聯(lián)素的表達(dá),而增加高分子質(zhì)量脂聯(lián)素的比例有關(guān)[8]。

      游離脂肪酸升高是引起胰島素抵抗的一個(gè)獨(dú)立高危因素,與脂解增強(qiáng)、成脂減弱有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)肥胖或胰島素抵抗時(shí),參與脂肪代謝的關(guān)鍵因子,如ACC[10]、FAS[11]、ATGL[12]、AFABP[13]等表達(dá)出現(xiàn)異常,這些指標(biāo)可能成為2型糖尿病早期胰島素抵抗的預(yù)測(cè)指標(biāo),甚至成為未來(lái)肥胖治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小檗堿能夠顯著抑制成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)FAS、AFABP、ATGL mRNA表達(dá),且存在一定的量效、時(shí)效關(guān)系。另外,Bae等[14]還發(fā)現(xiàn)5 μmol/L小檗堿即能有效抑制分化過(guò)程中3T3-L1脂肪細(xì)胞多種成脂酶或蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá),其中在脂肪細(xì)胞分化第7天加入小檗堿,F(xiàn)AS mRNA表達(dá)幾乎達(dá)到完全抑制。以上說(shuō)明小檗堿對(duì)分化中、成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞成脂基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)均有抑制作用。推論小檗堿在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)脂肪細(xì)胞成脂的抑制效應(yīng)顯著,這可能是其最終阻礙脂肪形成,抑制脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制之一。

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      (2014-01-01收稿 2014-02-20修回)

      (本文編輯 閆娟)

      Effects of Berberine on Inflammatory Factors,Adipokines and Fatty Acid Metabolism in 3T3-L1 Adipocytes

      LI Ping1,YUE Jingjing2,ZHANG Da3,NIU Wenyan3,HE Qing1
      1 Department of Endocrinology,Tianjin Medical University General Hospital,,Tianjin 300052,China;2 Department of Internal Medicine 2,Wuhe County People’s Hospital,Anhui Province;3 Department of Immunology,Tianjin Medical University

      Objective To observe the effects of berberine on inflammatory factors,adipokines and fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes,and to investigate the molecular mechanism underlying berberine’s role of improving insulin resistance.MethodsmRNA level of inflammatory molecules,adipokines,key enzymes and protein in fatty acid metabolism in 3T3-L1 cells were determined by quantitative real time polymerase chain reaction(qRT-PCR)after cells were treated with different concentrations of berberine(0,5,10,20,40 μmol/L)for 24 hours and with 10 μmol/L berberine at different durations(0,4,8,24,48 h).These factors mainly included interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor-α(TNF-α),leptin,adiponectin,visfatin,fatty acid synthase(FAS),acetyl-CoA carboxylase(ACC),adipose triglyceride lipase(ATGL)and adipocyte fatty acid binding protein(AFABP).ResultsIn 3T3-L1 adipocytes,transcription level of IL-6,TNF-α,leptin,FAS,ATGL,AFABP reduced with addition of berberine dosage at 10~40 μmol/L(P<0.05)while visfatin mRNA level increased(P<0.05)compared with the control group.No significant difference was found in expression of adiponectin(P>0.05).Transcription level of IL-6,TNF-α,leptin,AFABP,ATGL,FAS decreased with time after 10 μmol/L berberine intervention(8-48 h)compared with the control group(P<0.05).On the other hand,visfatin mRNA level increased(P<0.05)compared with the control group.Adiponectin mRNA decreased only after cells were treated with berberine for 48 h(P<0.05).No significant difference was found transcription of ACC between each groups treated with berberine(P>0.05).ConclusionmRNA level of inflammatory factors,adipokines,key enzymes and protein in fatty acid metabolism in 3T3-L1 adipocytes can be affected by berberine and this effect depend on its dose and time.This might be the mechanisms underlying berber-ine to improve insulin resistance.

      berberine;insulin resistance;interleukin-6;tumor necrosis factor-alpha;leptin;adiponectin;visfatin; acetyl-CoA carboxylase;fatty acid synthase;adipose triglyceride lipase;adipocyte fatty acid binding protein;gene expression

      R587.1

      A

      10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.001

      *國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào):81170740);天津市科委科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):09ZCZDSF04500)

      1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科(郵編300052);2安徽省五河縣人民醫(yī)院內(nèi)2科;3天津醫(yī)科大學(xué)免疫系

      △通訊作者 E-mail:hech69@hotmail.com

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