重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)再生長的影響*

張少華， 曹福元， 張永杰， 田 青， 王建枝

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，湖北 武漢 430030)

周圍神經(jīng)損傷是一類常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如:三叉神經(jīng)痛、臂叢神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、視神經(jīng)炎、面神經(jīng)炎、面肌痙攣等，多由維生素缺乏、感染、外傷、中毒、壓迫、缺血和代謝障礙等原因引起，軸突變性和節(jié)段性脫髓鞘是其主要的特征性病理改變。損傷后常伴有所支配效應(yīng)器功能異常，如:骨骼肌運(yùn)動(dòng)障礙、頑固性疼痛等。由于上述特點(diǎn)，周圍神經(jīng)損傷給患者帶來極大痛苦，探索積極有效的治療方法是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是一種能促進(jìn)多種神經(jīng)元存活和分化、保護(hù)神經(jīng)元免受損傷并阻止神經(jīng)元退行性變的神經(jīng)活性蛋白［1］。研究發(fā)現(xiàn)CNTF能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸突再生［2－4］，但缺乏對(duì)受損神經(jīng)功能恢復(fù)的直接評(píng)價(jià)。故本實(shí)驗(yàn)以大鼠坐骨神經(jīng)損傷為模型，在損傷部位肌肉內(nèi)注射CNTF，觀察CNTF對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)再生長影響，并與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的作用進(jìn)行對(duì)比研究，從神經(jīng)功能的恢復(fù)方面評(píng)價(jià)CNTF對(duì)神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組

雄性Wistar大鼠(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)共60只，體重(250±20)g。隨機(jī)將動(dòng)物分成正常對(duì)照組、模型組、CNTF 給藥小劑量組(48 μg/kg)、中劑量組(216 μg/kg)、大劑量組(1080 μg/kg)、NGF 給藥組(20 μg/kg)，每組各 10只。建立模型，Wistar大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，備皮，消毒，于左后肢沿坐骨神經(jīng)走向正中部切開皮膚，鈍性分離顯露坐骨神經(jīng)，在梨狀肌下緣8－10 mm處。先在10倍手術(shù)顯微鏡下以9－0無創(chuàng)縫線將神經(jīng)鞘膜縫第1針，再完全切斷生骨神經(jīng);又縫第2針，將兩斷端縫合好。逐層將肌肉及皮膚縫合，并進(jìn)行消炎處理。4個(gè)給藥組在損傷處分別肌注小劑量 CNTF(48 μg/kg)、中劑量 CNTF(216 μg/kg)。大劑量CNTF(1080 μg/kg)和 NGF(20 μg/kg)。模型組肌注等容量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d后，每2 d給藥1次至45 d。

2 電生理實(shí)驗(yàn)

將各組動(dòng)物用藥45 d后分別進(jìn)行檢測(cè)神經(jīng)動(dòng)作電位的潛伏期和傳導(dǎo)速度。在神經(jīng)損傷處切開皮膚沿神經(jīng)走行鈍性分離坐骨神經(jīng)，用成都儀器廠生產(chǎn)的RM6240多導(dǎo)生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)的生物電輸入針形電極負(fù)端(藍(lán))插入左下腿皮下，電極正端(紅)插入切開口中間的肌肉下，電極地線(黑)與一針灸銀電極相連插入右腿。剌激電纜正端(紅)與一針灸銀電極相連，鉤住神經(jīng)損傷處的上端，負(fù)端(黑)與一針灸銀電極相連插在鼠尾上，檢測(cè)出神經(jīng)動(dòng)作電位的潛伏期，其參數(shù)設(shè)定為剌激強(qiáng)度0.2 V、波寬0.2 ms、延時(shí)5 ms、濾波1 kHZ，將分離出的神經(jīng)放入神經(jīng)盒中連接RM6240儀器測(cè)定傳導(dǎo)速度［5］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 潛伏期

由圖1可知，模型組的神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期比正常對(duì)照組顯著增長(P＜0.01);與模型組相比較，CNTF各給藥組和NGF給藥組的潛伏期顯著縮短(P＜0.01);同時(shí)，CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg 的潛伏期顯著短于 CNTF 48 μg/kg 組(P ＜0.05);但是，CNTF 216 μg/kg 和 1080 μg/kg 組的潛伏期與NGF給藥組之間無顯著差別(P＞0.05)。

Figure 1.The effect of intramuscular injection of CNTF and NGF for 45 d on the latent period of action potential in all groups..n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs 48 μg/kg CNTF.圖1 術(shù)后45 d肌肉注射CNTF及NGF對(duì)各組神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期的影響

Figure 2.The effect of intramuscular injection of CNTF and NGF for 45 d on the conduction velocity of action potential..n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs 48 μg/kg CNTF;▲▲P ＜0.01 vs 20 μg/kg NGF.圖2 術(shù)后45 d肌肉注射CNTF及NGF對(duì)各組神經(jīng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響

2 傳導(dǎo)速度

由圖2可知，與正常對(duì)照組相比，模型組的傳導(dǎo)速度顯著降低(P ＜0.01);CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg組的傳導(dǎo)速度比模型組、NGF給藥組顯著增快(P＜0.01)，比CNTF 48 μg/kg組也顯著增快(P＜0.05);CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg組的傳導(dǎo)速度無顯著差異(P＞0.05);CNTF 48 μg/kg組和NGF給藥組的傳導(dǎo)速度比模型組有增快的趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)。

討 論

CNTF是由200個(gè)氨基酸組成的酸性蛋白，分子量22－24 kD，因由對(duì)睫狀神經(jīng)元生長具有強(qiáng)烈作用而命名。睫狀神經(jīng)生長因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，在功能上與NGF和腦源性生長因子(brain driver growth factor，BDNF)有交叉性。但在發(fā)育過程中的表達(dá)卻與NGF和BDNF有所不同。

研究表明CNTF在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的雪旺細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞漿中表達(dá)，對(duì)包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞有廣泛的作用［6］。Siegel等［7］在缺乏CNTF基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)，無論是切斷神經(jīng)使肌肉失神經(jīng)支配或是其它原因?qū)е录∪獍c瘓，都不能發(fā)現(xiàn)神經(jīng)芽生。而當(dāng)給予外源性CNTF后，則可發(fā)現(xiàn)較多的不典型的芽生反應(yīng)。因此認(rèn)為CNTF是神經(jīng)芽生過程中一個(gè)非常重要的因素。Cui等［8］發(fā)現(xiàn)CNTF可以促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突長入周圍神經(jīng)移植物。Newman等［9］發(fā)現(xiàn)CNTF能增加再生軸突末端的數(shù)量，增強(qiáng)再生軸突髓鞘的重新形成，說明CNTF可能對(duì)周圍神經(jīng)和骨骼肌同樣有效。在神經(jīng)損傷時(shí)，CNTF大量釋放從而起到對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)CNTF在切割傷后的神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端發(fā)生退行性變化的神經(jīng)組織中仍可表達(dá)，呈向上調(diào)節(jié)趨勢(shì);通過神經(jīng)趨化因子的表達(dá)，為神經(jīng)再生與功能修復(fù)提供合適的微環(huán)境［10］。同時(shí)CNTF通過抑制caspase－3的表達(dá)，防止受損運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡［11］。

本實(shí)驗(yàn)通過在坐骨神經(jīng)損傷處直接肌注不同劑量的CNTF和NGF，測(cè)定神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期和傳導(dǎo)速度。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組相比較，CNTF各給藥組神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期顯著縮短(P＜0.01)，傳導(dǎo)速度顯著增快(P＜0.01);同時(shí)，中劑量、大劑量CNTF給藥組和NGF給藥組對(duì)神經(jīng)動(dòng)作電位潛伏期的影響無顯著差別(P＞0.05)，但是中劑量、大劑量CNTF給藥組的神經(jīng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度比NGF組顯著增快(P＜0.01)。這說明CNTF對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)再生和功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用，而且中劑量、大劑量 CNTF的作用優(yōu)于NGF。所以，如果在治療周圍神經(jīng)損傷病例中，通過局部誘導(dǎo)CNTF表達(dá)增強(qiáng)或外源性添加CNTF，可為神經(jīng)再生和功能恢復(fù)創(chuàng)造良好的條件。

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