黃宏耀 陳巍巍 張秋瑩 劉方方 鄧 濤 謝圣高

腫 瘤細胞表面存在 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),它有 10余個家族成員,屬于 I型跨膜蛋白,可通過識別相關病原的分子模式及某些內源性配體引發(fā)信號傳導和炎癥介質釋放。研究證實Toll樣受體4(TLR-4)可介導腫瘤細胞的免疫逃逸和浸潤功能。本文應用實時熒光定量PCR(Realtime PCR)檢測結腸癌及癌旁組織中TLR-4 mRNA水平,為TLR-4基因表達與結腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移的關系研究提供資料。

1 資料與方法

1.1 材料

63例結腸癌組織及其癌旁正常組織(距離肉眼可見的癌組織≥2cm以上取材)組織標本來自本院2006年2月至2009年3月間結腸癌手術患者,均經組織病理學確診,癌旁正常組織經過病理檢測無癌細胞浸潤,病例均未經過放、化療,其中男女性各為37、26例,有無淋巴結轉移各為 27、36例,高、中、低分化各為 23、17、20 例;Dukes'A 、B、C、D 期各為 18、14、22、9 例。

1.2 試劑與儀器

TLR-4引物:上游:5'-AGCCACCTCTCTACCTTAATATTGA-3',下游:3'-CCGAGTGTTA GAATAG GTTAGAAA G-5',Prism?7900型熒光定量 PCR儀(ABI,美國),Trizol Reagent(Invitrogen,美國),反轉錄試劑盒(TOYOBO,日本),熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,美國)。

1.3 cDNA制備和熒光定量PCR方法

所有結腸癌組織和癌旁正常組織均分別按照 Trizol試劑說明書提取總RNA,然后根據反轉錄試劑說明將總RNA逆轉錄成cDNA。Realtime PCR體系為25μl,按照下列順序依次加入反轉錄產物、上游引物、下游引物各、熒光染料共12.5μl至 EP管中,補水至總體積25μl,同時制作標準品曲線。PCR反應程序為 95℃變性 5 min,94℃、60℃、72℃各20s,55個循環(huán)后,72℃保溫5 min,55℃10s。每樣本設置3個平行孔,取拷貝數(shù)均值進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

各組Realtime PCR結果根據標準曲線讀取,以絕對定量數(shù)值表示,用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件得出均數(shù)±標準差(±s),組間差異比較采用方差分析t檢驗,P＜0.05為有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結 果

結腸癌組織TLR-4m RNA表達量明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。低分化型結腸癌高于高、中分化結腸癌(P＜0.01)。有淋巴結轉移者與無淋巴結轉移者 TLR-4mRNA表達量差異無顯著性(P＞0.05)。Dukes'A期 TLR-4mRNA表達量低于B、C、D期(P＜0.01),B、C、D期之間差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 結腸癌患者TLR-4mRNA表達結果比較(±s)

表1 結腸癌患者TLR-4mRNA表達結果比較(±s)

注:與癌旁組織比較,1)P＜0.01;與高、中分化結腸癌比較,2)P＜0.01;與Dukes'A期結腸癌比較,3)P＜0.01

n TLR4 mRNA拷貝數(shù)結腸癌 63 86.42±15.161)癌旁組織 63 32.74±9.44高分化結腸癌 23 69.58±11.27中分化結腸癌 17 64.57±13.91低分化結腸癌 20 97.12±15.442)結腸癌伴淋巴結轉移 27 89.91±13.22結腸癌不伴淋巴結轉移 36 81.16±13.59 Dukes'A期結腸癌 18 59.05±11.66 Dukes'B期結腸癌 14 92.32±17.513)Dukes'C期結腸癌 22 91.41±15.213)Dukes'D期結腸癌 9 101.46±17.343)

3 討 論

研究證實,腫瘤細胞尤其是上皮源性腫瘤細胞表面存在TLR,其在腫瘤的發(fā)病機制和生物免疫治療中可能起到一定的作用。TLR可被存在于局部的相應配體激活,啟動上皮細胞的惡性表型轉化,同時分泌細胞因子,刺激腫瘤細胞生長。TLR-4信號途徑的持續(xù)激活被認為是慢性炎癥持續(xù)存在進而發(fā)展為惡性腫瘤的重要原因[1,2]。

本文結果表明63例結腸癌組織中TLR-4 mRNA的表達比鄰近正常結腸組織明顯升高,提示TLR-4基因高表達可能參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展,其機制與TLR-4介導腫瘤細胞的免疫逃逸和浸潤功能有關,結腸癌細胞本身或者其釋放的細胞因子作為TLR-4配體發(fā)揮作用,激活 TLR-4,上調TLR-4 m RNA水平,通過一系列信號途徑,誘發(fā)結腸癌。近來在肺癌、喉癌的研究中也發(fā)現(xiàn),TLR-4在癌細胞或浸潤炎癥細胞上的高表達與腫瘤的免疫逃逸密切相關[3,4]。

本文結果顯示低分化型(包括Dukes'B、C、D期)結腸癌TLR-4m RNA明顯高于高、中分化(Dukes'A期)結腸癌,且從高分化到低分化表現(xiàn)為漸進性上升,提示TLR-4參與了結腸癌的分化進程。但結腸癌淋巴轉移與否的TLR-4mRNA表達沒有明顯差異,提示TLR-4基因表達水平高低不能區(qū)分結腸癌是否經淋巴轉移。

1 Bauera K,Dixon D,Degraff L M,et al.Toll-lik e receptor 4 in buty latod hydroxytoluene-induced mouse pulmonary inflammation and tumorigenesis.J Nail Cancer Inst,2005,97(23):1 778～1 781.

2 Ishida I,Kubo H,Suzuki S,et al.Hypoxia diminishes Toll-like receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondfia in endothelial ceils.J Immunol,2002,169(4);2 069～2 075.

3 He W,Liu Q,Wang L,et al.TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Mol Immunol,2007,44(11):2 850～2 859.

4 Szczepański M,Stelmachowska M,Stryczyński L,et al.Assessment of expression of toll-like receptors 2,3 and 4 in laryngeal carcinoma.EurArch Otorhinolaryngol,2007,264(5):525～530.