何士敏,李昌滿,于文博
(長江師范學院生命科學與技術學院,重慶涪陵,408100)
莖瘤芥 (Brassica junceaCoss.var.tumida Tsen et Lee)的瘤莖表皮青綠光滑,皮下肉質色白而肥厚,質地脆嫩。瘤莖部分,即青菜頭,一般每個質量0.5 kg左右,大者1~1.5 kg。莖瘤芥用途十分廣泛,煮熟的青菜頭拌上調料食用十分可口;其煮后的湯有一種雞湯式的鮮味。用青菜頭制成的泡菜,顯得嫩脆別致。現(xiàn)代科學化驗證明,它的營養(yǎng)十分豐富,每500 g青菜頭含有蛋白質 20.5 g、糖 45 g、鈣 1 400 mg、磷 650 mg、鐵 33.5 mg。莖瘤芥還是做榨菜的主要原料,現(xiàn)代營養(yǎng)學認為,榨菜能健脾開胃、補氣添精、增食助神;低鹽保健型榨菜還能起到保肝減肥的作用;榨菜有“天然暈海寧”之說,暈車暈船者在口中放一片榨菜咀嚼,會使煩悶情緒緩解;飲酒不適或過量時,吃一點榨菜可以緩解酒醉造成的頭昏、胸悶和煩躁感[1]。因此,莖瘤芥在人們日常生活中的地位是很重要的。目前,加強我國莖瘤芥種子生產和種子活力方面的研究已經(jīng)引起研究人員的高度重視,如果在堅持良種繁育和品種復壯的同時,又采取提高種子活力的措施,則能大大提高我國莖瘤芥的產量。
過氧化氫作為種子萌發(fā)促進劑,以價格低廉、使用方便,在科研和農業(yè)生產上得到廣泛應用[2~3]。因此,本文研究了不同濃度的過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)的影響,探討提高莖瘤芥種子活力的途徑,旨在為莖瘤芥生產實踐提供一些科學參考。
供試的莖瘤芥種子有:涪陵早豐、鵝公雪松和永安小葉等3個品種,由重慶涪陵何亞種子經(jīng)營部供種。
①種子發(fā)芽試驗 取15套中等型號的培養(yǎng)皿,分為3個組,每組5套,在每個培養(yǎng)皿中放入籽粒飽滿、顏色健康的莖瘤芥種子50粒,再用適量(剛好浸沒種子上表面)蒸餾水(對照),0.01%,0.1%,1%,3%的 H2O2溶液分別浸泡,加蓋,處理12 h。將浸種后的種子洗凈,置于經(jīng)高壓滅菌、墊有2層濕潤紗布的培養(yǎng)皿中,并加入適量蒸餾水,在25℃光照下進行萌發(fā)試驗,每天記載發(fā)芽種子數(shù),并用蒸餾水清洗1次種子。
試驗過程中統(tǒng)計供試種子數(shù)、逐日實際發(fā)芽數(shù)和平均苗長(m),計算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值、活力指數(shù)[2]。a.發(fā)芽指標測定。發(fā)芽后測定過氧化物酶活性和多酚氧化酶活性。發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)(Gt為 t時間內的發(fā)芽數(shù),Dt為相應的發(fā)芽天數(shù))[4];活力指數(shù)=平均苗長×發(fā)芽指數(shù)。
b.過氧化物酶(POD)活性測定。參照俞建英等[7]的方法,略有改動。稱取經(jīng)處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g,加20 mmol/L KH2PO45 mL,于研缽中冰浴研磨成勻漿,以4 000 r/min離心15 min,收集上清夜保存在冷處,所得殘渣再用5 mL KH2PO4溶液提取1次,合并2次上清液作為酶液保鮮備用。取光徑1 cm比色杯2只,于1只中加入反應混合液3 mL,KH2PO40.5 mL,作為校零對照,另1只中加入反應混合液3 mL,上述酶液0.5 mL,立即開啟秒表記時,于分光光度計470 nm波長下測量OD值,每隔1 min讀數(shù)1次,一共讀5 min。以平均每分鐘OD的變化量表示酶活性大小。
c.多酚氧化酶(PPO)活性測定。參照李敏等[8]的方法,略有改動。稱取經(jīng)不同處理后的種子萌發(fā)的芽0.2 g,加pH值7.6的磷酸緩沖液10 mL,在研缽中冰浴研磨成勻漿轉入離心管,以4 000 r/min離心15 min,取其上清液作為酶液。然后取2只光徑1 cm的比色杯,于1只中加入pH值磷酸緩沖液1 mL,0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL,作為校零對照。另1只中加入pH值7.6磷酸緩沖液1 mL,0.2 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL,上述酶液0.5 mL,用分光光度計在波長410 nm條件下測定OD值,每5 s記錄1次。酶活力單位為每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。
②過氧化氫對種子電解質外滲率的影響 參照張志良[5]的方法,略有改動。先測定活種子外液電導率:對3個品種的莖瘤芥種子分別用適量蒸餾水,0.01%,0.1%,1%,3%H2O2浸泡處理 24 h,然后取處理后的種子各50粒,用蒸餾水洗凈,再用濾紙吸干。最后將種子放入500 mL錐形瓶中,加蒸餾水250 mL,保持24 h,搖動錐形瓶,使溶液均勻,過濾到250 mL燒杯中,用DDS_11A型電導率儀測定溶液的電導率。
其次,測定死種子外液電導率:分別用蒸餾水,0.01%,0.1%,1%,3%H2O2溶液對 3 個品種的莖瘤芥種子進行浸泡處理24 h,取處理后的種子各50粒,用蒸餾水洗凈,再用濾紙吸干,將種子放在500 mL燒杯中,加蒸餾水250 mL,在電爐上加熱20 min將其煮死,待溶液冷卻之后,滴加蒸餾水至加熱前的刻度,以補充蒸發(fā)掉的水分,搖動燒杯,使溶液均勻,再過濾到250 mL燒杯中,測定溶液的電導率。
電解質外滲率(%)=活種子外液電導率/煮死種子外液電導率×100%[6]。
圖1 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽率的影響
①發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的變化 a.采用不同濃度的過氧化氫浸種處理3個品種的莖瘤芥種子,隨著過氧化氫濃度的不斷增加,3個品種的種子發(fā)芽率均先升高后降低,0.01%~0.1%濃度的過氧化氫處理種子,可以使其發(fā)芽率升高,當濃度為0.1%時,發(fā)芽率達到最高值;0.1%以上濃度的過氧化氫明顯抑制種子的萌發(fā),降低種子的發(fā)芽率。b.3個品種的種子,與對照相比,經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后,涪陵早豐種子的發(fā)芽率最大增幅為21個百分點,永安小葉種子的發(fā)芽率最大增幅為17個百分點,而鵝公雪松種子的發(fā)芽率最大增幅為10個百分點,說明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率效果最佳(圖1)。
不同濃度的過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響和對發(fā)芽率的影響基本一致(圖1,圖2)。
②發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)的變化 從圖3可以看出,a.隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高,3個品種的種子發(fā)芽率高峰值先升高后降低,0.01%~0.1%濃度的過氧化氫處理種子,可以使種子發(fā)芽率高峰值升高,當濃度為0.1%時,發(fā)芽率高峰值達到最高;而0.1%以上濃度的過氧化氫明顯降低了種子的發(fā)芽率高峰值。b.3個品種的種子,與對照相比,經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后,涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值最大增幅為9個百分點,永安小葉為7個百分點,而鵝公雪松為8個百分點,這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的發(fā)芽率高峰值效果最佳。
圖2 不同濃度過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽指數(shù)的影響
從圖4可以看出:a.隨著過氧化氫處理濃度的不斷升高,3個品種的種子活力指數(shù)先升高后降低,0.01%~0.1%濃度的過氧化氫可以提高莖瘤芥種子的活力指數(shù),當濃度為0.1%時,其活力指數(shù)達到最高值;而過氧化氫濃度超過0.1%時則開始降低種子的活力指數(shù)。b.3個品種的種子,與對照相比,經(jīng)不同濃度過氧化氫浸種處理后,涪陵早豐種子的活力指數(shù)最大增幅為127%、永安小葉為74%、而鵝公雪松種子的活力指數(shù)最大增幅為76%,這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子的活力指數(shù)效果最佳。
綜上所述,0.1%的過氧化氫處理的種子,其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽高峰值以及活力指數(shù)均最高,這表明,0.1%的過氧化氫對提高種子活力具有一定作用。3個品種的種子,經(jīng)過氧化氫浸種之后,涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大,這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子活力效果最好。
圖3 過氧化氫對莖瘤芥種子發(fā)芽率高峰值的影響
圖4 過氧化氫對莖瘤芥種子活力指數(shù)的影響
圖5 過氧化氫對莖瘤芥種子電解質外滲率的影響
圖6 過氧化氫對莖瘤芥種子萌發(fā)期POD活性的影響
從圖5可以看出,隨著過氧化氫處理的濃度不斷升高,3個品種的種子電解質滲透率逐漸升高,這表明過氧化氫可以腐蝕和軟化種皮,增加種皮的通透性,軟化和通透性增加的種皮,不僅有利于萌發(fā)代謝時的水分、氧氣和二氧化碳的吸收交換,更有助于胚芽破皮萌發(fā)。
從圖6可以看出,隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高,3個品種的種子萌發(fā)期的POD活性先升高后降低,0.01%~0.1%的過氧化氫處理種子,可以使種子萌發(fā)芽的POD活性升高,當濃度為 0.1%時,其POD活性達到最高;當處理濃度超過0.1%時,POD活性逐漸降低。
從表1可以看出,隨著過氧化氫處理的濃度不斷提高,3個品種的種子萌發(fā)期的PPO活性先升高后降低,0.01%的過氧化氫處理的種子,其PPO活性最高;當處理濃度超過0.01%時,PPO活性逐漸降低。
表1 不同濃度H2O2對莖瘤芥種子多酚氧化酶活性的影響
綜上所述,一定濃度的過氧化氫浸種不僅可以提高種子的發(fā)芽率和活力指數(shù),還可提高一些相關酶的活性。分析其原因認為,這是一個由內到外的表現(xiàn)過程,當種子機體內的酶活性提高和代謝加強時,外在就表現(xiàn)出發(fā)芽率和活力指數(shù)相應的升高。
表2 莖瘤芥種子活力指數(shù)與其酶活性的相關系數(shù)
由表2可以看出,莖瘤芥種子活力指數(shù)與 POD活性相關系數(shù)較大,呈顯著的正相關(r=0.862 1),其中POD活性可能是決定種子活力大小的主要因素之一。
①0.1%的過氧化氫處理的種子,其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值以及活力指數(shù)均最高,這表明,0.1%的過氧化氫對提高種子活力具有一定作用。
②3個品種的種子,經(jīng)過氧化氫浸種之后,涪陵早豐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率高峰值和活力指數(shù)增幅均最大,這表明過氧化氫浸種對提高涪陵早豐種子活力效果最好。
③0.01%過氧化氫處理的種子,其多酚氧化酶活性最高;0.1%過氧化氫處理的種子,其過氧化物酶活性最高。這表明適宜濃度的過氧化氫浸種可以提高種子的相關酶活性。
過氧化氫在適當濃度下具有促進作物種子萌發(fā)的作用。傳統(tǒng)觀點認為它可輕度腐蝕種(果)皮,提高其透性,為種子提供充足的氧氣而解除休眠[9]。但徐是雄等[10]指出,過氧化氫主要是刺激胚乳物質代謝-磷酸戊糖途徑,它對解除種子休眠具有重要作用。通過本文的研究表明,一定濃度過氧化氫不僅促進種子的萌發(fā),提高其活力指數(shù),還提高種子物質代謝水平上相關酶活性,因此可認為,過氧化氫促進種子萌發(fā)與物質代謝密切相關。
適宜濃度過氧化氫浸種處理的莖瘤芥種子,其發(fā)芽率和過氧化物酶、多酚氧化酶活性明顯高于對照處理,表明種子的物質代謝水平由于受到過氧化氫刺激而發(fā)生改變。代謝的改變調節(jié)主要在4個水平上進行:細胞水平、酶水平、激素水平和神經(jīng)水平,其中酶水平的調節(jié)是所有生物最基本的調節(jié)。酶水平的調節(jié)又包括酶活和酶量的調節(jié),本文認為,過氧化氫浸種提高種子萌發(fā)期的酶活性屬于酶含量的調節(jié),但也不排除屬于酶活性調節(jié)的可能性。過氧化氫作為氧化劑,它可直接調控蛋白激酶及磷酸酯酶的活性[11~12],并可以與DNA上的反應元件直接相互作用,這樣便可以選擇誘導許多相關基因的表達,從而可以增加酶含量,以提高自身的免疫能力以及代謝水平,代謝得到提高和加強,種子中的貯藏物質加快轉化為簡單的化合物運輸?shù)秸谏L的幼苗中,提供幼苗生長需要的物質和能源。物質轉化率越高對幼苗的生長越有利,并可以提高幼苗抗逆性[6],所以外在表現(xiàn)出種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)以及相關酶的活力得到提高。
任何代謝水平的調節(jié),都必須作用于細胞并通過信號轉導系統(tǒng)而發(fā)揮作用,過氧化氫作為植物中可能存在的新的信號分子,是否以第一信使和第二信使2種形式同時存在,是一個令人感興趣的問題[6],所以過氧化氫對種子萌發(fā)、活力的提高機理還有待進一步研究和探討。
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