王 鑫 遲乃玉 董 碩 陳 璨 張慶芳

目前反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)飼料常用的是微貯飼料和青貯飼料，但是兩者都有共同的缺陷——飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低。提高反芻動(dòng)物纖維質(zhì)等粗飼料的轉(zhuǎn)化率和利用率是提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要途徑，也是實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)跨越式發(fā)展的必要條件[1]。而復(fù)合微生態(tài)酶制劑則能解決這一問(wèn)題，它們通過(guò)維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡而發(fā)揮作用,具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育,提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等多種功能,且無(wú)污染、無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性和對(duì)環(huán)境無(wú)害等,是一類新型綠色環(huán)保飼料添加劑。本文主要進(jìn)行了反芻動(dòng)物飼用復(fù)合微生態(tài)酶制劑發(fā)酵玉米秸稈的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

酵母菌 JM-BC、JM-29、JM-34、JM-66、JM-75，由大連大學(xué)生物工程學(xué)院微生物工程研究小組選育。

乳酸菌R4，由大連大學(xué)生物工程學(xué)院微生物工程研究小組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

①酵母菌保藏培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基。②乳酸菌保藏培養(yǎng)基：用葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.2%、酵母膏0.2%、瓊脂1.8%、蒸餾水1 L，加熱溶解后，每支8 ml量分裝入18 mm×180 mm大試管中，121℃滅菌20 min，冷卻，4℃冰箱保藏。③PDA固體培養(yǎng)基。④PDA液體培養(yǎng)基：a.PDA液體試管培養(yǎng)基（按照8 ml量分裝入18×180 mm大試管中，121℃滅菌20 min，冷卻，4℃冰箱保藏）；b.PDA液體小三角瓶培養(yǎng)基（按照25 ml量分裝入100 ml三角瓶中，加入25粒玻璃珠，121℃滅菌20 min，冷卻，4℃冰箱保藏）；c.PDA液體大三角瓶培養(yǎng)基（按照250 ml量分裝入500 ml大三角瓶中，加入80粒玻璃珠，121℃滅菌20 min，冷卻，4℃冰箱保藏）。⑤PDA斜面試管培養(yǎng)基。⑥乳酸菌固體試管培養(yǎng)基：同乳酸菌保藏培養(yǎng)基。⑦混菌發(fā)酵培養(yǎng)基：秸稈粉40 g、麩皮10 g、4倍的 Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽水溶液（Mandels，1978）[2]，混勻后，取60 g混菌發(fā)酵培養(yǎng)基裝入大罐頭瓶中，用12層紗布封口，121℃滅菌20 min，冷卻，4℃冰箱保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單一菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 培養(yǎng)方法

在PDA斜面試管培養(yǎng)基上輕輕挑取一環(huán)菌種，接種于PDA液體試管培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，按5%接種量接種于PDA液體小三角瓶培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，按照5%的接種量接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)，在發(fā)酵的第 1、2、3、5、7 d 分別測(cè)定 ADF 含量和蛋白質(zhì)含量。

1.2.1.2 纖維素含量的測(cè)定

測(cè)定酸性洗滌纖維(ADF)（吳平等，1994）[3]。

1.2.1.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用微量凱氏定氮法（吳平等，1994）[4]。

1.2.2 復(fù)合酵母菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

JM-BC在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h，JM-34在30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，JM-66在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h，JM-29和 JM-75在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至36 h。5種酵母菌按照1：1：1：1：1比例，共5%的接種量接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)，分別在發(fā)酵的第 1、2、3、5、7 d 后測(cè)定 ADF含量和蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 乳酸菌添加時(shí)間的研究

①菌種的擴(kuò)培：在乳酸菌固體試管培養(yǎng)基上30℃靜置培養(yǎng)36 h后，接種于裝有8 ml麥芽汁液體培養(yǎng)基的大試管中，30℃靜置培養(yǎng)36 h后，按5%的接種量接種于裝有25 ml麥芽汁液體培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)36 h后得發(fā)酵液。

②添加時(shí)間的設(shè)計(jì)：五種酵母菌混菌發(fā)酵24、36、48 h后分別按照5%的添加量添加乳酸菌發(fā)酵液，發(fā)酵3 d后，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中ADF含量和蛋白質(zhì)含量并對(duì)發(fā)酵秸稈進(jìn)行感觀鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵ADF含量的變化

五株酵母菌分別接種于混菌培養(yǎng)基后單獨(dú)發(fā)酵和其按照1：1：1：1：1比例混菌發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物中ADF含量隨時(shí)間的變化如表1、圖1。

表1 不同發(fā)酵菌株ADF含量變化（%）

由圖 1 可見：JM-BC、JM-29、JM-75 發(fā)酵對(duì)纖維含量幾乎沒有影響；JM-66影響不大；JM-34發(fā)酵3 d后，纖維含量有明顯下降；添加復(fù)合菌發(fā)酵后纖維降解率最大，發(fā)酵3 d后，ADF含量為41.2%，比對(duì)照降低10.2%。3 d后ADF含量降低不再明顯，考慮到成本和發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短，取3 d作為復(fù)合菌的發(fā)酵周期?？梢钥闯鎏砑痈骶l(fā)酵后，纖維的降解率和各菌株發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶活的大小成正相關(guān)。

圖1 不同菌株發(fā)酵ADF含量變化

2.2 不同菌株發(fā)酵蛋白質(zhì)含量的變化

五株酵母菌分別接種于混菌培養(yǎng)基后單獨(dú)發(fā)酵和其按照1：1：1：1：1比例混菌發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化如表2、圖2。

表2 不同發(fā)酵菌株蛋白含量變化（%）

由圖2可以看出，添加復(fù)合菌發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白的增加量最大，發(fā)酵3 d后，蛋白含量為9.03%，比對(duì)照增加11.3%。發(fā)酵3 d后的蛋白含量變化不大，分析原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，復(fù)合菌中纖維素酶合成的減少，使得酵母生長(zhǎng)必需的碳源減少，抑制酵母的生長(zhǎng)，因而蛋白含量增加緩慢。

2.3 乳酸菌添加時(shí)間的確定

分別在五株酵母混菌發(fā)酵24、36、48 h后添加乳酸菌，共發(fā)酵3 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3、圖3。

圖2 不同發(fā)酵菌株蛋白含量變化

表3 乳酸菌添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

圖3 乳酸菌添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由圖3可以看出，五種酵母混菌發(fā)酵36 h后添加乳酸菌R4，發(fā)酵3 d后得到的發(fā)酵秸稈的粗纖維含量最低，ADF降解率為10.0%；蛋白含量最高，蛋白增加為11.5%。在酵母菌混菌發(fā)酵36 h后添加乳酸菌R4復(fù)合發(fā)酵3 d后效果最好。

3 結(jié)論與討論

反芻動(dòng)物飼用的復(fù)合微生態(tài)酶制劑發(fā)酵玉米秸稈，JM-BC在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h，JM-34按照正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，30℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，JM-66在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h，JM-29和 JM-75分別在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至36 h。五種酵母菌分別擴(kuò)培后按照1：1：1：1：1比例共5%的接種量混菌發(fā)酵36 h,添加5%接種量的乳酸菌R4，復(fù)合發(fā)酵3 d后，產(chǎn)物蛋白含量提高11.5%，ADF含量降低10.0%。發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生復(fù)合的酒香味和酸香味，黃色，有光澤，無(wú)霉臭味，質(zhì)地柔軟，濕潤(rùn)蓬松。

根據(jù)微貯的作用機(jī)理、作用效果和微生態(tài)制劑對(duì)反芻動(dòng)物的作用[5]，我們認(rèn)為反芻動(dòng)物飼用復(fù)合微生態(tài)酶制劑方面，以后研究中應(yīng)該主要解決的問(wèn)題有：第一，發(fā)酵工藝的優(yōu)化，使調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物自身微生態(tài)平衡的菌株（主要是各種乳酸菌）和降解秸稈的纖維素及提高蛋白質(zhì)含量的各種菌株[6]（主要是霉菌及酵母）能同時(shí)達(dá)到一個(gè)理想的作用效果（本課題已就此進(jìn)行了研究）；第二，利用遺傳操作等生物技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，篩選高效穩(wěn)定的產(chǎn)酶菌株。

飼用復(fù)合微生態(tài)酶制劑對(duì)反芻動(dòng)物具有促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率、抗病、促進(jìn)生長(zhǎng)等作用[7]，而且生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期較之青貯和微貯短。因此，隨著研究的進(jìn)一步深入，新一代復(fù)合微生態(tài)酶制劑必將更加廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中[8]。

[1]陳碧祥,吳振強(qiáng).飼料用酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用[J].糧食儲(chǔ)藏,2002（5）:40-44.

[2]Mandels M.Cellulase Production by a new mutant strain of trichoderma reesei McG 77[J].Bioeng Symp,1978(8):89-101.

[3]吳平,周禮聰，等.食品分析(第一版)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1994:198.

[4]吳平,周禮聰,等.食品分析(第一版)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1994:216-219.

[5]帥麗芳,段銘,等.微生態(tài)制劑對(duì)反芻動(dòng)物的影響 [J].飼料博覽,2001（12）:36-37.

[6]陳翠微,劉長(zhǎng)江,等.微生物發(fā)酵農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的研究與應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2002,279(4):291-292.

[7]那日蘇,桂榮,趙青余,等.反芻家畜酵母培養(yǎng)物的研究[J].飼料研究 ,2004(01)：43-45.

[8]唐茂妍,王海彥,計(jì)成.最佳酶制劑應(yīng)用體系（OEA）的理論與實(shí)踐[J].飼料工業(yè),2009，30(1):40-44.