羅小軍 孔憲炳 閻雄 周江山

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，重慶 400016

在哺乳動(dòng)物中，Hedgehog（HH）信號(hào)通路主要由HH配體（Sonic hedgehog，Shh；Indian hedgehog，Ihh；Desert hedgehog，Dhh），2個(gè)跨膜蛋白受體Ptch和Smo，核轉(zhuǎn)錄因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）組成。HH信號(hào)通路在胚胎時(shí)期對(duì)組織分化及發(fā)育調(diào)節(jié)起了巨大作用，最近越來越多的研究顯示，其激活能導(dǎo)致多種腫瘤形成，如基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道腫瘤等［1-3］，但Sonic Hedgehog（SHH）信號(hào)通路在肝癌中的作用國(guó)內(nèi)報(bào)道尚不多。本研究旨在通過免疫組織化學(xué)和RTPCR法檢測(cè)SHH信號(hào)通路中Shh、Gli2在人肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細(xì)胞系和組織中的表達(dá)，研究Shh和Gli2表達(dá)與HCC臨床病理之間的關(guān)系，探討Shh和Gli2在HCC中的表達(dá)及其臨床意義，為肝癌的防治研究尋求新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2007年2月—2008年8月期間重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的肝癌及肝內(nèi)膽管結(jié)石手術(shù)切除患者的標(biāo)本。所有患者均經(jīng)病理確診，肝癌30例，另外收集肝硬化患者標(biāo)本20例，正常肝組織標(biāo)本10例。30例肝癌標(biāo)本中，男性23例，女性7例；年齡36～73歲，平均年齡52.7歲；腫瘤直徑平均5.9 cm（2.1～13.0 cm），根據(jù)Edmondson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ 級(jí)17例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)13例；伴有肝內(nèi)門靜脈侵犯12 例，無肝內(nèi)門靜脈侵犯18 例；肝癌伴有肝硬化17 例，肝癌無肝硬化13 例；肝癌伴乙肝陽(yáng)性26 例，肝癌無乙肝陽(yáng)性4 例；肝癌伴血清甲胎蛋白升高（＞25 ng/mL）22例，肝癌血清甲胎蛋白正常（≤25 ng/mL）8例。收集10例新鮮肝癌組織及癌旁肝組織標(biāo)本（距離肝癌腫塊5 cm以上），手術(shù)后立刻置液氮凍存。所有標(biāo)本都經(jīng)組織病理學(xué)確診。人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 試劑 兔抗人Shh、Gli2多克隆抗體購(gòu)自武漢中美科技有限公司，兔抗人Smo多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。SP試劑盒及DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自天根生化科技公司，RT試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)制備切片。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Shh和Gli2的表達(dá)，檢測(cè)方法按試劑盒操作說明，切片常規(guī)脫蠟至水，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑37 ℃條件處理10 min，微波抗原修復(fù)；山羊血清封閉后，滴加一抗（Shh為1∶150稀釋，Gli2為1∶100稀釋，Smo為1∶50稀釋）4 ℃過夜；生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37 ℃反應(yīng)30 min后，辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37 ℃反應(yīng)15 min，DAB顯色，蘇木精對(duì)比復(fù)染，脫水，透明，封固。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：普通光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中所占比例判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)染色程度的不同評(píng)分：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分；兩者積分的乘積作為染色結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），＞4分為陽(yáng)性（++～+++）。

1.3.2 RT-PCR法檢測(cè) Shh和Gli2 mRNA的表達(dá) 肝癌組織在液氮冷凍條件下，將標(biāo)本組織研磨成粉末，趁液氮尚未完全揮發(fā)，每100 mg組織加1.0 mL TRIzol裂解液，吹打均勻，充分裂解后把液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，加0.2 mL氯仿抽提RNA，再加等體積異丙醇沉淀RNA，最后用DEPC處理水充分溶解RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，A260/A280比值在1.8～2.0，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量5×106個(gè)），TRIzol法提取總RNA，按TaKaRa公司兩步法試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列、產(chǎn)物大小如表1所示。PCR擴(kuò)增體系25 μL，反應(yīng)條件為：Shh 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；最后再72 ℃延伸 5 min；Gli2 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。RT-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像系統(tǒng)拍照分析。

表1 Shh基因引物序列及產(chǎn)物大小Tab.1 Primers and fragment sizes of SHH signaling genes

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，采用Fisher精確檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SHH信號(hào)通路表達(dá)的結(jié)果 30例HCC標(biāo)本中，Shh、Gli2蛋白染色陽(yáng)性率分別是63.3%（19/30）和66.7%（20/30）。Shh蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕褐色顆粒；Gli2蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。檢測(cè)結(jié)果顯示，正常肝組織中無SHH信號(hào)通路蛋白Shh、Gli2的表達(dá)。在部分肝硬化組織中也檢測(cè)到了SHH信號(hào)通路蛋白Shh、Smo蛋白的表達(dá)（圖1）。

2.2 SHH信號(hào)通路蛋白的表達(dá)與HCC臨床病理的關(guān)系 由表2可見Gli2蛋白表達(dá)與HCC肝內(nèi)門靜脈侵犯及腫瘤病理分級(jí)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在伴有肝門靜脈侵犯和腫瘤組織低分化的HCC中Gli2蛋白高表達(dá)。Gli2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、是否合并肝硬化及HBV感染無明顯相關(guān)性。Shh蛋白表達(dá)與HCC各臨床病理特征均無明顯相關(guān)性。血清腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白在臨床中常用作為肝癌患者診斷和復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，經(jīng)檢測(cè)顯示血清甲胎蛋白與HCC中SHH通路蛋白Shh、Gli2的表達(dá)無明顯相關(guān)（P＞0.05）。

2.3 RT-PCR檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞系中SHH信號(hào)通路表達(dá)的結(jié)果 Shh、Gli2 mRNA在HCC組織表達(dá)率分別為60%（6/10）和70%（7/10），與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致。癌旁組織中Shh和Gli2 mRNA表達(dá)率為20%（2/10）、30%（3/10），Shh和Gli2 mRNA在HCC組織表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HepG2、Huh7細(xì)胞系均有Shh和Gli2 mRNA的表達(dá)。SHH信號(hào)通路在Huh7中表達(dá)高于HepG2，但兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2，表3）。

圖2 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines

表2 SHH信號(hào)通路蛋白的表達(dá)與HCC臨床病理的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of SHH signaling protein and clinical features of HCC(n)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

*: Compared with adjacent-tumor tissues group; △: Compared with Huh7 group.

3 討 論

在哺乳動(dòng)物中，HH信號(hào)通路主要由Hedgehog配體（Shh、Ihh和Dhh）、2個(gè)跨膜蛋白受體Ptch和Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）組成。當(dāng)HH信號(hào)通路激活時(shí)，HH配體與Ptch結(jié)合，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制效應(yīng)，Smo進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)激活下游轉(zhuǎn)錄因子Gli，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化。

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的形成是多步驟、多階段的過程，可能由多種基因參與，涉及多條信號(hào)通路，但發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。Sicklick等［4］在HCC中檢測(cè)到SHH信號(hào)通路基因Shh、Ptch、Smo和Gli1高表達(dá)，說明HCC中存在SHH信號(hào)通路的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh、Gli2蛋白在HCC組織中大量表達(dá)，而在正常人肝組織中無陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，提示參與肝臟早期的胚胎發(fā)育及組織分化的SHH信號(hào)通路在肝癌中大量激活，可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展［5-6］，而成熟的正常肝組織中無SHH信號(hào)通路表達(dá)［7］。SHH信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7中存在表達(dá)，且在Huh7中表達(dá)高于HepG2，這種差異可能是由于SHH信號(hào)通路在不同肝癌細(xì)胞系中激活不同所致。

本研究在部分肝硬化組織中檢測(cè)到SHH信號(hào)通路的表達(dá)，說明SHH信號(hào)通路不僅在肝癌中表達(dá)，而且SHH信號(hào)通路在肝硬化中也有激活。這與先前研究的在原發(fā)性膽汁性肝硬化病變和其他肝硬化組織中存在SHH信號(hào)通路的異常激活一致［4,8］。Huang等［9］在部分肝癌癌旁組織中檢測(cè)到SHH信號(hào)通路表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些癌旁組織存在細(xì)胞分化不良甚至有微小癌灶，而其他分化良好的癌旁組織中則無SHH信號(hào)通路表達(dá)。由此說明，SHH信號(hào)通路的激活可能發(fā)生在HCC的早期階段。

本研究進(jìn)一步分析了SHH信號(hào)通路基因的表達(dá)與HCC腫瘤相關(guān)病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果顯示Gli2的表達(dá)在伴有肝門靜脈侵犯和低分化的HCC組中明顯高于在無肝門靜脈侵犯和高分化的HCC組，提示Gli2的表達(dá)可能與肝癌的惡性程度相關(guān)。近來Kim等［10］采用反義寡核苷酸方法在肝癌中通過抑制Gli2基因的表達(dá)可以下調(diào)c-Myc、Bcl2和上調(diào)p27的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，說明針對(duì)SHH信號(hào)通路的特異性靶向治療將可能成為肝癌治療的一條新途徑。

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