韌皮部特異性啟動(dòng)子研究概況

于文靜，王玉富，邱財(cái)生，郝冬梅，薛召東

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

亞麻是一種重要的韌皮纖維作物，亞麻纖維具有拉力強(qiáng)、柔軟、細(xì)度好、導(dǎo)電弱、吸水散水快、膨脹率大等特點(diǎn)，可紡高支紗，制高級(jí)衣料。木質(zhì)素對(duì)亞麻纖維的性能和品質(zhì)具有較大影響，木質(zhì)素對(duì)于亞麻具有支撐作用，沒有木質(zhì)素亞麻就會(huì)倒伏，但在亞麻加工的脫膠過程中，木質(zhì)素又是難以去除的成分，所以控制木質(zhì)素合成的量就顯得尤為重要。韌皮部特異啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游基因在植物的韌皮部特異表達(dá)，如果利用韌皮部特異啟動(dòng)子構(gòu)建木質(zhì)素生物合成中的某個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)到植物中就可以控制該基因的表達(dá)活性，這樣對(duì)于纖維部分的木質(zhì)素生物合成也有所控制。

啟動(dòng)子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因的上游。一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合在啟動(dòng)子上即可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，因此啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，它與RNA聚合酶以及其他蛋白輔助因子等反式元件的相互作用是啟動(dòng)子調(diào)控模式的實(shí)質(zhì)[1，2]。隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，它是基因工程表達(dá)載體的重要元件。因此研究啟動(dòng)子的克隆方法，對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。近年來又有許多改進(jìn)的克隆啟動(dòng)子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來改進(jìn)的啟動(dòng)子克隆方法作一下綜述，以期促進(jìn)對(duì)啟動(dòng)子分離技術(shù)的應(yīng)用。

1 植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與分類

1.1 植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征是：1）+1處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（帽子位點(diǎn)），一般為A，兩邊通常為嘧啶堿基[3，4]。2）以-25～-30位為中心的區(qū)域，其富含AT序列，稱為TATA_box，它是啟動(dòng)子主要的功能性成分，TATA_box的序列為TATA[A/T]A[A/T]。TATA_box是RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的位點(diǎn)，也是一些反式作用因子與DNA相互作用的位點(diǎn)之一。TATA_box指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上，使其在正確的位置開始轉(zhuǎn)錄。3）以轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)-75位為中心的CAAT_box，一般位于-70～-300位的范圍內(nèi)，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率，其保守序列為GC（C/T）CAATCT，沒有CAAT_box基因的，以一個(gè)類似的AGGA_box來代替。CAAT_box可以從正反兩個(gè)方向起作用，并且與其它順式元件有協(xié)同作用。植物中與CAAT_box結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子可能也是一種異源三聚體復(fù)合物，但不同的是植物CAAT_box復(fù)合物的亞基是由多個(gè)基因編碼的。因此植物中可能存在多種CAAT_box結(jié)合復(fù)合物和組合調(diào)控（combination control）方式[5]。（4）啟動(dòng)子的一個(gè)顯著特點(diǎn)是富含A/T。一般認(rèn)為A/T堿基對(duì)容易解鏈，有利于轉(zhuǎn)錄的起始。在豌豆和菜豆等[6，7，8，9，10]植物基因的啟動(dòng)子研究中發(fā)現(xiàn)，A/T富含序列既可以作為正調(diào)控因子也可以扮演負(fù)調(diào)控因子的角色。（5）除了A/T富含序列外，在啟動(dòng)子上還存在著一些與反式因子相互作用的正負(fù)調(diào)控序列。

1.2 啟動(dòng)子的分類

習(xí)慣上，將植物基因的啟動(dòng)子按其基因的表達(dá)方式分為組成型啟動(dòng)子（即基因的表達(dá)不受時(shí)空限制和某種物質(zhì)的誘導(dǎo)而在植物中表達(dá)出來）、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（其基因的表達(dá)受某種物質(zhì)的誘導(dǎo)，沒有誘導(dǎo)物存在，基因表達(dá)水平很低甚至沒有）和組織或器官特異性啟動(dòng)子（其基因的表達(dá)分布在植物的某個(gè)組織或器官中）。

最常用的一種啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子。植物激素、植物生長發(fā)育和環(huán)境信號(hào)的復(fù)雜交互作用調(diào)控植物的生長發(fā)育[11]。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能控制基因在特定時(shí)期、特定部位表達(dá)，這既避免了目的基因在寄主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)對(duì)寄主細(xì)胞生長的影響，又可使寄主細(xì)胞對(duì)諸如熱激、光照、創(chuàng)傷等特定的環(huán)境信號(hào)作出反應(yīng)。因此，強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于建立一個(gè)高效、實(shí)用的表達(dá)系統(tǒng)是非常重要的。

基因在不同發(fā)育階段及組織中表達(dá)是植物本身生長發(fā)育的需要?；虻奶禺惐磉_(dá)關(guān)鍵在于其啟動(dòng)子中特異的順式因子及一些特異的轉(zhuǎn)錄因子的不同。已有很多報(bào)道是關(guān)于組織特異性啟動(dòng)子的研究，矮牽牛（Petunia hybrida Vilm）的花特異表達(dá)啟動(dòng)子SA[12]，種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子PsGNS2啟動(dòng)子[13]，植物細(xì)胞頂尖生長特異的IRE啟動(dòng)子[14]，表皮特異的表達(dá)的CUT1啟動(dòng)子[15]，富甘氨酸蛋白質(zhì)基因（GRP1.8）的木質(zhì)部細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子[16]，韌皮部細(xì)胞中表達(dá)的玉米蔗糖合成酶基因啟動(dòng)子Sh[17]。

2 植物啟動(dòng)子克隆的幾種方法

2.1 利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子

啟動(dòng)子探針型載體是一種有效、經(jīng)濟(jì)、快速分離基因啟動(dòng)子的工具型載體，其包含2個(gè)基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測(cè)單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；檢測(cè)單元?jiǎng)t包括1個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因以及克隆位點(diǎn)[41]。這種方法在微生物中應(yīng)用得比較多，在植物中主要是利用PCR技術(shù)。

2.2 利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子

即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)引物，克隆基因的啟動(dòng)子，由于PCR法簡便快捷，近年來人們較多采用此方法克隆基因啟動(dòng)子。彭仁旺等[18]根據(jù)已報(bào)道的序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，從煙草中克隆了花藥特異表達(dá)。蔣浩等[19]用PCR方法從美洲黑楊基因組DNA中擴(kuò)增到了BSA基因啟動(dòng)子片段基因TA-29的啟動(dòng)子。上述的PCR方法簡便、快捷、操作簡單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。但是這種方法是在建立了知道基因的全序列的基礎(chǔ)上，只有這樣才能根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出目的基因的啟動(dòng)子，對(duì)于未知基因序列的啟動(dòng)子克隆，還需要利用其他的方法進(jìn)行研究。

2.3 環(huán)狀PCR

環(huán)狀PCR包括I-PCR（Inverse-PCR）和P-PCR（Panhandle-PCR）。這兩種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR。

2.3.1 I-PCR

I-PCR是1988年由Triglia[20]最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3.2 P-PCR

P-PCR是由Jones等[21]提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板。其過程為，首先酶切基因組DNA，產(chǎn)生5'或3'粘末端，然后連接上合適的接頭（primer 3），連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭，由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，能有效地?cái)U(kuò)增2～9kbp的大片段未知序列。

2.4 利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動(dòng)子

這類方法的第一步都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭，既可以用pUCl8等質(zhì)粒載體，也可以使用λDNA等噬菌體載體，只要選用的載體帶有合適的酶切位點(diǎn)；同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈，然后根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物或接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。

2.4.1 利用載體PCR

Shyamala等[22]利用的單特異性引物PCR（SSP-PCR）對(duì)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子為起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)步行。以M13mpl8RF DNA為載體。用PstI和AraI酶切基因組DNA，PstI和XmaI酶切載體DNA，然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，由于非特異片段沒有單特異引物結(jié)合的位點(diǎn)，即使有載體連到非特異片段，也無法得到大量擴(kuò)增，而使特異片段得到有效擴(kuò)增。

2.4.2 利用接頭PCR

王新國等[23]利用銜接頭的方法，設(shè)計(jì)出了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，增加了反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取得了新的進(jìn)展。首先將胡蘿卜基因組DNA分別用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV四種酶切，并設(shè)計(jì)了1個(gè)銜接頭長鏈序列和1個(gè)銜接頭短鏈序列，并在銜接頭短鏈的3'末端帶有1個(gè)氨基的銜接頭，能夠阻止聚合酶催化的銜接頭短鏈的延伸，同時(shí)銜接頭的長鏈和短鏈之間是反向重復(fù)序列。將酶切片段與此銜接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以銜接頭引物和基因特異引物做PCR，在首輪PCR中只有限定的遠(yuǎn)端基因特異引物有結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)基因特異引物延伸產(chǎn)生的DNA鏈通過銜接頭時(shí)，才能產(chǎn)生銜接頭引物的結(jié)合位點(diǎn)，PCR才能以銜接頭引物和基因特異引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。而另一方面，如果非特異合成產(chǎn)生了DNA兩端都有雙鏈銜接頭序列的PCR產(chǎn)物時(shí)，這種PCR產(chǎn)物在每次變性后，單鏈DNA末端的銜接頭反向重復(fù)序列將形成鍋柄結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)比引物-模板雜交更穩(wěn)定，能抑制非特異序列的指數(shù)增長。最后得到主要的PCR產(chǎn)物為3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。將EcoR V-銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序、同源性比較，得到1個(gè)新的胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子序列，它含有類似于TATA box和CAAT box的元件，在啟動(dòng)子的遠(yuǎn)上游區(qū)域含多個(gè)AT富含區(qū)，該啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究植物中的糖代謝具有重要的意義。

2.5 TAlL-PCR

很早就有用隨機(jī)引物的PCR，但由于無法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以一直未能廣泛應(yīng)用。近年來由Liu等[24]設(shè)計(jì)的TAIL-PCR（Termal Asymmetric Interlaced PCR）又叫熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR，則解決了這個(gè)問題，后來有研究表明，經(jīng)改良過的TAIL-PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側(cè)序列，從而為啟動(dòng)子的克隆提供了有效的新方法。在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：（1）由特異性引物和簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；（2）由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；（3）由同一簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，其中后2種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。

TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（specialprimer，簡稱sp1，sp2，sp3，約20bp），用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡并引物（Arbitrarydegenerate primer，AD，約14bp）相組合，以基因組DNA為模板，根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物。

TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應(yīng)和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。5次高特異性反應(yīng)，使sp1與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反應(yīng)使簡并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)[25，26]。

經(jīng)上述反應(yīng)得到不同濃度的3種類型產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物（I型）和非特異性產(chǎn)物（II型和III型）。第二次反應(yīng)將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了環(huán)化和連接，速度快，特異性強(qiáng)，效率高，靈敏，但是其步驟比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求也較高[26]。

3 韌皮部特異啟動(dòng)子的研究

韌皮部特異性啟動(dòng)子在植物、植物病原物（細(xì)菌、病毒等）中都存在，憑借該類啟動(dòng)子，病原物可利用韌皮部運(yùn)輸?shù)酿B(yǎng)分完成自身的生長繁殖，或造成系統(tǒng)侵染[29]。韌皮部特異性啟動(dòng)子區(qū)別于其它類型啟動(dòng)子的一個(gè)顯著特點(diǎn)是在該類啟動(dòng)子序列中存在一段與啟動(dòng)子的韌皮部特異性表達(dá)有關(guān)的基序。將幾種韌皮部特異性啟動(dòng)子的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)13nt的保守序列T/ATAAGT/AACGAAT/CC/A，可能與韌皮部特異表達(dá)有關(guān)，推測(cè)（G/C）（G/C）TATG序列可能也與啟動(dòng)子的韌皮部特異性及啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)[32]。這里介紹幾個(gè)植物來源的韌皮部啟動(dòng)子。

3.1 筍瓜韌皮部蛋白（PP2）基因啟動(dòng)子

PP2蛋白是葫蘆科植物韌皮部中大量存在的蛋白，一種獨(dú)特的結(jié)合幾丁質(zhì)的凝集素，具有韌皮部組織特異性。Bostwick等[30，31]對(duì)筍瓜幼苗PP2蛋白的原位免疫雜交表明該基因產(chǎn)物特異地定位于韌皮部伴胞中。蔣浩等[33]根據(jù)已知的筍瓜PP2基因全序列，擴(kuò)增出PP2基因啟動(dòng)子的987bp片段。分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)有富含A/T的區(qū)域和富含A/T的重復(fù)序列，將該啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)GUS基因在葉柄、莖、葉、根的韌皮部都顯著表達(dá)，還通過基因組DNA步移法擴(kuò)增克隆了南瓜PP2基因啟動(dòng)子（npp2）序列后，并對(duì)該啟動(dòng)子作了缺失分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了增強(qiáng)型npp2啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子和原啟動(dòng)子比較GUS活性明顯提高，且仍然為組織特異性表達(dá)。胡桂兵等[34]根據(jù)PP2基因的啟動(dòng)子序列擴(kuò)增出目標(biāo)片段后，構(gòu)建了含綠色熒光蛋白報(bào)告基因新植物表達(dá)載體。

3.2 玉米蔗糖合酶-1基因啟動(dòng)子

玉米蔗糖合酶-1（sucrose synthase Sh）基因編碼蔗糖合成酶1同工酶，這種酶在玉米種子的胚乳中高水平表達(dá)，在根中表達(dá)甚微，在綠色組織和花粉中無表達(dá)。對(duì)該基因啟動(dòng)子-GUS融合基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的研究表明，該啟動(dòng)子具有韌皮部組織特異表達(dá)的活性，而在其它營養(yǎng)組織細(xì)胞（表皮、木質(zhì)部、髓和皮質(zhì)細(xì)胞）中均無GUS表達(dá)的活性。

3.3 油菜（Brassica napus）伸展蛋白基因啟動(dòng)子

伸展蛋白即富含羥脯氨酸-糖蛋白（HRGP），是一類主要的細(xì)胞壁蛋白。它的主要特征是具有五肽（ser-pro-pro-pro-pro）的重復(fù)基元。Shirsat等[35，36]將該基因啟動(dòng)子的1.0kb的片段與GUS基因融合后轉(zhuǎn)入煙草和油菜，比較了兩者表達(dá)的異同，在轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因的表達(dá)定位于根部周層與側(cè)根起始有關(guān)的細(xì)胞中，在葉中未檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因油菜中，GUS基因的表達(dá)定位于根部維管組織的韌皮部細(xì)胞，而在側(cè)根分生組織及周層與側(cè)根形成有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)無GUS表達(dá)。

3.4 楊樹樹皮儲(chǔ)藏蛋白基因啟動(dòng)子

樹皮儲(chǔ)藏蛋白BSP是一多基因家族編碼的蛋白。蔣浩等[19]用PCR方法從美洲黑楊基因組中DNA擴(kuò)增并克隆到了BSP基因啟動(dòng)子片段，該啟動(dòng)子具有富含A/T的區(qū)域和富含長達(dá)19bp的A/T重復(fù)序列，這種結(jié)構(gòu)特征可能有利于轉(zhuǎn)錄的起始，在大多數(shù)植物啟動(dòng)子中A/T富含序列都和基因轉(zhuǎn)錄活性的正調(diào)控有關(guān)。它與GUS融合基因轉(zhuǎn)化煙草表明該啟動(dòng)子可介導(dǎo)GUS基因在煙草韌皮部組織特異表達(dá)的特點(diǎn)。在BSP蛋白家族中，bspA基因已被克隆并測(cè)序。Zhu等[46]將bspA啟動(dòng)子的2.8kb與β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA）融合后轉(zhuǎn)化楊樹，在轉(zhuǎn)基因楊樹中觀察到GUS活性定位于韌皮部。

除了上述的幾種植物來源韌皮部特異啟動(dòng)子，還有已報(bào)道的另一些韌皮部特異啟動(dòng)子，如擬南芥蔗糖合成酶基因（ATASUS1）啟動(dòng)子、楊樹咖啡酰輔酶A-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（CCoAOMT）啟動(dòng)子等。在植物細(xì)胞分化過程中韌皮部特異性啟動(dòng)子對(duì)某些特定基因的表達(dá)調(diào)控及韌皮部的形成可能起著重要作用，所以研究這類啟動(dòng)子的特殊調(diào)控功能還將會(huì)有助于人們對(duì)細(xì)胞分化分子基礎(chǔ)的了解。

目前韌皮部特異啟動(dòng)子在亞麻中的研究還很少，有關(guān)種子特異啟動(dòng)子的研究在亞麻中有報(bào)道[52]，而且主要是研究其它植物種子特異啟動(dòng)子在亞麻中的表達(dá)分析，亞麻植物本身的特異啟動(dòng)子還沒有得到。

4 討 論

目前，啟動(dòng)子克隆方法絕大多數(shù)是建立在PCR的基礎(chǔ)上的染色體步行技術(shù)，利用啟動(dòng)子克隆的方法不僅可以克隆到基因的啟動(dòng)子，同時(shí)還可以用于克隆cDNA的全長[38，45，46]。研究真核基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的鑒定程序是，應(yīng)用一系列的突變技術(shù)對(duì)目的基因啟動(dòng)子序列作體外誘變處理，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中做進(jìn)一步的功能分析。常用的體外突變技術(shù)有單側(cè)缺失突變（one-sided deletion mutagenesis）、內(nèi)部缺失突變（internal deletion mutagenesis）、銜接物掃描突變（linker-scanningmutagenesis）以及定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）等[51]。對(duì)于韌皮部特異啟動(dòng)子在亞麻植物中的研究，目前理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)還不完善，所以首先是要進(jìn)行亞麻基因組的研究，以及找到可以在韌皮部特異表達(dá)的基因，測(cè)出這些基因的全長，再利用反向PCR技術(shù)克隆出韌皮部特異性啟動(dòng)子，或者用上述的其他克隆啟動(dòng)子的方法得以實(shí)現(xiàn)韌皮部特異啟動(dòng)子的克隆。在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因在不同的組織或器官中表達(dá)是生物工程研究的一個(gè)方向和熱點(diǎn)，韌皮部特異性啟動(dòng)子的不斷發(fā)現(xiàn)與研究，不僅使人們對(duì)組織特異啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)有更深入的認(rèn)識(shí)，而且還可為組織分化的研究及植物基因工程提供有應(yīng)用價(jià)值的新型啟動(dòng)子元件。

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