應(yīng)用分子標(biāo)記探討多胚亞麻的分類地位

康慶華 ，黃文功 ，劉 巖 ，姜衛(wèi)東 ，趙東升 ，宋喜霞 ，孫中義 ，吳廣文 ，關(guān)鳳芝

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究中心，哈爾濱 150086）

多胚亞麻品系1-6Ha-3是從俄羅斯引進(jìn)的多胚種質(zhì)D95029（形態(tài)特征接近油用亞麻）與纖維亞麻抗6的雜交后代中多胚種子產(chǎn)生的單倍體苗加倍后獲得的雙單倍體（DH）品系。該品系形態(tài)特征明顯區(qū)別于油用亞麻，更接近纖維亞麻，而且株高、工藝長(zhǎng)等農(nóng)藝性狀都優(yōu)于親本。經(jīng)兩年的所內(nèi)鑒定，其原莖產(chǎn)量、纖維產(chǎn)量、全麻率都高于對(duì)照品種黑亞11號(hào)和黑亞14號(hào)，同時(shí)具有高頻率的多胚特性。為直接用于生產(chǎn)或作為優(yōu)良育種親本更好的利用，明確其在栽培亞麻品種中的地位及與各品種間的遺傳差異非常必要。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多成功應(yīng)用RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)和SSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記）等分子標(biāo)記技術(shù)探討物種的分類及親緣關(guān)系的研究報(bào)道[1-8]。隨后，基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的ISSR（inter-simple sequence repeat，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)，因其具有重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，也被廣泛用于作物遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源的分類和鑒定、重要農(nóng)藝基因的定位與遺傳作圖上[9-10]。本研究以RAPD技術(shù)和ISSR技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)所獲得的多胚DH品系1-6Ha-3與其他23個(gè)亞麻品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，旨在為多胚亞麻品種的鑒定、保護(hù)和分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。同時(shí)也為篩選亞麻多胚性分子標(biāo)記的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2008年6月至2009年1月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試24個(gè)亞麻品種（系）均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，見(jiàn)表1。

表1 供試的24份亞麻材料Table 1 Twentyfour materials ofLinum usitatissmum L.for the experiment

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提?。簛喡榭侱NA的提取試驗(yàn)參考王關(guān)林、方宏筠的方法[11]，取0.2g亞麻幼嫩葉片，加500 μL CTAB（內(nèi)含0.4%巰基乙醇和1%PVP），用液氮研磨，利用購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序：按黃文功（2009）的方法[12]進(jìn)行。

1.2.2.1 引物：供試引物包括RAPD隨機(jī)引物70條：A1～A16，S1～S50，S61～S64；ISSR引物21條，選自丁明忠等（2009）在苧麻分子標(biāo)記中篩選到的U系列引物[13]。以上引物均購(gòu)自上海生工。

1.2.2.2 PCR 反應(yīng)體系：總體積 25 μL：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/LMgCl21.0 μL，2.5 mmol/LdNTP 2.5μL，primer（25μmol/L）1.5μL，GenomeDNA2μL（50ng），5U/μLTaq酶0.2μL，加ddH2O至總體積25μL。Marker：100bpladder。以上常規(guī)試劑均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2.3 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性40 s，37℃退火1 min，72℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳。EB（溴化乙錠）染色，紫外分析儀上檢測(cè)并照相。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)：綜合各引物的擴(kuò)增圖譜，篩選在這24份材料中擴(kuò)增豐富且多態(tài)性好的引物。各擴(kuò)增產(chǎn)物的記錄以所用引物加上其相對(duì)分子量大小表示，每一條帶在某一個(gè)樣品存在賦值“1”，缺乏賦值“0”，強(qiáng)帶和可重復(fù)的弱帶賦值均為“1”。數(shù)據(jù)錄入NTSYSpc2.10e軟件，計(jì)算各個(gè)樣品間的遺傳相似性系數(shù)（GS），對(duì)得到的遺傳相似性矩陣進(jìn)行非加權(quán)組法（UPGMA）聚類分析，建立該多胚亞麻品系與其他供試品種（系）間的親緣關(guān)系圖。根據(jù)遺傳相似系數(shù)計(jì)算出遺傳距離GD（遺傳距離=1-遺傳相似度）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選

選擇一定數(shù)量的引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增是獲得客觀結(jié)果的前提。本試驗(yàn)在隨機(jī)選擇的70條RAPD引物和21條ISSR引物中篩選出對(duì)供試亞麻材料能擴(kuò)增出清晰的譜帶、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物10條，其中RAPD引物5條，ISSR引物5條（見(jiàn)表2）。

2.2 亞麻DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 24個(gè)亞麻品種的DNA多態(tài)性

篩選出的10條引物擴(kuò)增的帶型較理想，多態(tài)性較好，3次重復(fù)擴(kuò)增的結(jié)果一致。這10個(gè)引物共擴(kuò)增出115條帶，其中同源片段28條，多態(tài)性條帶87條，多態(tài)性比例為75.7%。平均每條引物擴(kuò)增出11.5條帶，譜帶大小一般在200～2000bp，也有極少數(shù)在100bp～200bp之間或超過(guò)2000bp。其中擴(kuò)增譜帶最多的引物是U835（15條），擴(kuò)增出的譜帶最少的引物有A5和U853，各為9條。表2為10條引物在24個(gè)亞麻品種中的擴(kuò)增結(jié)果。圖1、圖2和圖3為選用3個(gè)引物A12、A5和U853的基因組DNA的指紋圖譜。

表2 10條引物的RAPD和ISSR擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Ten primers and their RAPDand ISSR amplification results

圖1 引物A12在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)（表 1）；M.100bp ladderFig.1 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer A121-24：flaxvarieties sample number（table 1）；M：100bp ladder

圖2 引物A5在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)（表 1）；M.100bp ladderFig.2 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer A51-24：flaxvarieties sample number（table 1）；M.100bp ladder

圖3 引物U853在24個(gè)亞麻品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果1-24.亞麻品種編號(hào)（表 1）；M.100bp ladderFig.3 PCR amplification results ofthe 24 flaxcultivars usingprimer U8531-24：flaxvarieties sample number（table 1）；M.100bp ladder

2.2.2 聚類分析結(jié)果

根據(jù)10個(gè)引物的擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得到24個(gè)亞麻品種（系）的遺傳相似度值（表3）和遺傳聚類樹(shù)狀圖（圖4）。24份亞麻種質(zhì)在閾值（遺傳相似系數(shù)）為0.73處分為四大類，V19（黑亞 11 號(hào)）、V18（Ariane）、V23（D97009-12）等 21 品種聚為第一大類，1-6Ha-3、黑亞 10 號(hào)、原05-15分別為第二、三、四類群。1-6Ha-3與其他23個(gè)亞麻品種的遺傳相似系數(shù)范圍分布在0.6522～0.7739之間，遺傳距離由大到小為V24/V21/V19＞V23＞V17＞V15/V4＞V16＞V20＞V13＞V3＞V22＞V14＞V6＞V18＞V12＞V2＞V8＞V10＞V11＞V7＞V1/V5。遺傳距離計(jì)算公式得：1-6Ha-3與黑亞 10號(hào)（V24）、原 2006-13（V21）、黑亞 11號(hào)（V19）三個(gè)品種的遺傳距離最遠(yuǎn)，都為 0.3478，與品種原 2005-21 白（V5）、98-338（V1）的遺傳距離相對(duì)最近，為 0.2261。

圖4 24個(gè)亞麻栽培品種的聚類分析Fig.4 Clusteringdiagramfor 24 cultivars ofLinum usitatissmum L.

3 結(jié)論與討論

3.1 在應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行植物品種分類及親緣關(guān)系鑒定過(guò)程中，引物的篩選是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，直接影響聚類結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中共篩選出的10個(gè)（5個(gè)RAPD和5個(gè)ISSR）引物擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶多、多態(tài)性豐富。利用這10個(gè)引物對(duì)包括多胚亞麻1-6Ha-3在內(nèi)的24份材料（系）的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，得到了115條清晰譜帶，其中87條屬于多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)性位點(diǎn)的比例達(dá)75.7%。該結(jié)果很好地揭示了這24份資源的遺傳多樣性，由此鑒定出各材料間存在著遺傳差異。根據(jù)這10個(gè)引物對(duì)每份材料的擴(kuò)增結(jié)果，將供試的24份亞麻種質(zhì)在閾值（相似系數(shù)）為0.73處分為四大類群，多胚品系1-6Ha-3獨(dú)為第二類群，且與其他23個(gè)亞麻品種的遺傳相似系數(shù)分布在0.6522～0.7739之間，說(shuō)明該品系與其他材料間都存在著較大的遺傳差異。并且從分子水平上鑒定出該多胚品系與黑亞10號(hào)（V24）、原 2006-13（V21）、黑亞 11 號(hào)（V19）、原 2005-15（V17）等品種的遺傳距離較大，與原2005-21（V5）、98-338、SXY20等品種的遺傳距離相對(duì)較近。一般地，遺傳距離較遠(yuǎn)或不同類型的材料間雜交時(shí)雜交優(yōu)勢(shì)較高[15]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可在1-6Ha-3和與其遺傳距離遠(yuǎn)的黑亞10號(hào)、原2006-13等品種間配制雜交組合，有可能從其雜交后代的多胚種子中獲得雜交優(yōu)勢(shì)高的單倍體植株，采用化學(xué)加倍或自然加倍方法達(dá)到快速固定雜交優(yōu)勢(shì)的目的。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為利用多胚亞麻固定雜種優(yōu)勢(shì)的研究提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

表3 24個(gè)亞麻基因型相似性系數(shù)矩陣Table 3 The genotype similaritymatrixof24 flax

3.2 本研究通過(guò)RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)認(rèn)定多胚亞麻與其他栽培亞麻品種之間的關(guān)系的分析結(jié)果表明，該方法能較好的用于分析亞麻屬種下樣品的遺傳距離，更能靈敏地揭示兩個(gè)關(guān)系相近的個(gè)體之間的遺傳差異。適合解決種下分類鑒定的問(wèn)題。并能為擴(kuò)大資源利用和研究提供新的線索。

3.3 由于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一些品種（系）間雖然植物學(xué)形態(tài)特征存在著較大差異，但分子標(biāo)記結(jié)果相似系數(shù)較高而聚為一類；也有部分品種（系）雖然形態(tài)表現(xiàn)出相似特征，但因分子標(biāo)記結(jié)果相似系數(shù)小卻未聚到一類。這可能是由于品種在長(zhǎng)期種植、選擇或雜交過(guò)程中，使其在地理分布、形態(tài)特征、生態(tài)類型等方面發(fā)生了較大的變異。因此，只有采用形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及多種分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的方法，以更多不同基因型種質(zhì)為試驗(yàn)樣本群體，才能更全面準(zhǔn)確的揭示遺傳變異，為新品種選育制訂策略，為親本選配、后代遺傳變異及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見(jiàn)性指導(dǎo)。為種質(zhì)資源的利用、新品種（系）的選育提供科學(xué)依據(jù)。

[1]Lee WB，et al.application ofrandomamplified polymorphic DNA（RAPD）tosystematics ofsome species ofLiliumin Korea[J].Korean Journal ofPlant Taxonomy，1993，23（2）：35-42.

[2]趙祥云，等.中國(guó)野生百合種質(zhì)資源及其研究利用[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[3]張克中.百合種質(zhì)擴(kuò)繁、親緣關(guān)系及雄性不育誘導(dǎo)研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2003.

[4]趙慶芳.百合栽培品種資源的RAPD分析[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，41（2）：30-33.

[5]Wen C S，et al.Genetic differentiation of Lilium longiflorum Thunb.var.scabrum Masami in Taiwan using random amplified polymorphic DNAand morphological characters[J].Bot Bull Acad Sin，1999.40：65-71.

[6]左志銳，穆鼎.百合遺傳多樣性及親緣關(guān)系的RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32（3）：468-472.

[7]王振東，等.大豆抗旱種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].大豆科學(xué)，2009，28（1）：26-30.

[8]鐘淮欽，等.觀賞向日葵種質(zhì)資源遺傳多樣性RAPD分析[J].分子植物育種，2009，7（1）：73-78.

[9]XIE Fu-ti，et al.Phylogenetic analysis of vegetable-type（Edamame））and grain-type soybean [Glycinemax（L.）Merr.]cultivars through ISSR marker[J].Soybean Science，2008，27（5）：732-739.

[10]HUO Guang，et al.Genetic diversityanalysis of 44 shares of hibiscus cannabinus L.germplasm resources using ISSR molecular[J].Agricultural Science&Technology，2009，10（3）：63-67.

[11]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[12]黃文功.亞麻RAPD的反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009.2：4-6.

[13]丁明忠，等.用ISSR分析四川苧麻品種（系）間的遺傳關(guān)系及雄性不育分子標(biāo)記的建立 [J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（2）：183-187.

[14]汪恩華，等.形態(tài)與分子標(biāo)記用于羊草種質(zhì)鑒定與遺傳評(píng)估的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（4）：68-75.

[15]別墅.中國(guó)3大主產(chǎn)棉區(qū)棉花品種遺傳多樣性的RAPD及其與農(nóng)藝性狀關(guān)系的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)，2001，34（6）：597-603.