施文元 周學(xué)東

（1.美國加州大學(xué)洛杉磯分校牙學(xué)院，美國 洛杉磯 CA 90045；2.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)，四川 成都 610041）

口腔微生物群由超過700種細(xì)菌組成[1]。大量臨床研究顯示，口腔微生物群與人體兩種常見口腔疾?。糊x病、牙周病有著密切的關(guān)系。在很長一段時期里，口腔微生物學(xué)家使用簡化論的研究手段，希望找出與口腔微生物疾病發(fā)病機制相關(guān)的關(guān)鍵病原微生物。但簡化論的局限性促使科學(xué)家們采取新的策略并提出了種群間相互作用、微生物群落、生物膜以及多微生物疾病等新概念。這些新的研究使口腔微生物學(xué)家們真正認(rèn)識到整體不是部分的簡單疊加，不同成分的相互作用會產(chǎn)生新的生理反應(yīng)，這些反應(yīng)在單獨研究這些成分時是無法觀察到的。本文重點討論人體口腔微生物群的相互作用。

1 口腔微生物群

Van Leeuwenhoek（1632—1723）最早開始對口腔微生物的最初觀察[2]。他對3 d不清潔的牙齒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在前牙牙齦上方的少量物質(zhì)中有一些活著的微小動物，并繪制這些微小生物的草圖，標(biāo)志著口腔微生物群落研究的開始。

Miller在Robert Koch博士的實驗室尋找導(dǎo)致齲病的“細(xì)菌”。1890年，他在《人類口腔中的微生物》一書中，首次提出關(guān)于齲齒發(fā)生的“化學(xué)細(xì)菌學(xué)說”，認(rèn)為牙菌斑生物膜由微生物組成。在頻繁攝入可發(fā)酵糖類的易感宿主中，菌斑微生物將這些糖類轉(zhuǎn)化為酸，導(dǎo)致牙齒脫礦。以Miller的化學(xué)細(xì)菌學(xué)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步獲得的臨床證據(jù)提示了牙菌斑生物膜在人體口腔疾病發(fā)生中的病原性。根據(jù)發(fā)生部位與齦緣的關(guān)系，牙菌斑可分為齦上菌斑和齦下菌斑。齦上菌斑以革蘭陽性鏈球菌為優(yōu)勢細(xì)菌，構(gòu)成了牙齒平滑面的微生物群落。當(dāng)飼以恰當(dāng)?shù)拇x底物時，這些群落就可能導(dǎo)致齲病的發(fā)生。齦下菌斑以革蘭陰性厭氧菌為優(yōu)勢菌，它們在牙周袋內(nèi)形成群落并可導(dǎo)致牙周病。Miller第一個提出去除菌斑是口腔疾病治療的基礎(chǔ)。

從1924年Clarke[3-4]對變異鏈球菌的初次分離到最近的以16S rRNA/DNA為基礎(chǔ)的大量口腔研究，已發(fā)現(xiàn)了人體口腔中超過700種細(xì)菌（革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和古細(xì)菌），使得口腔微生物群落成為人體最復(fù)雜的微生物集群之一。

齦上菌斑以革蘭陽性菌為優(yōu)勢菌，包括血鏈球菌、變異鏈球菌、緩癥鏈球菌、唾液鏈球菌和乳桿菌，而齦下菌斑則主要由革蘭陰性厭氧菌構(gòu)成，如放線桿菌、伴放線放線桿菌、福賽斯坦納菌、彎曲桿菌、二氧化碳噬纖維菌、嚙蝕艾肯菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌，以及口腔螺旋體如齒垢密螺旋體。在這兩種情況下，牙齒和牙齦組織上的微生物群落可在局限環(huán)境中積聚高濃度的細(xì)菌代謝產(chǎn)物（如脂肪酸代謝終產(chǎn)物、氨、過氧化氫、氧化物和二氧化碳），既會影響宿主，也會影響口腔微生物群中的細(xì)菌種群。

2 以群為基礎(chǔ)的口腔微生物發(fā)病機制

根據(jù)Koch的假說，對口腔微生物群分離和鑒定使微生物學(xué)家將特定微生物種屬與特定疾病聯(lián)系起來[5]。齦上菌斑中產(chǎn)酸的變異鏈球菌與齲病。醫(yī)學(xué)上的病原體都是“外來者，具有特殊的毒力因子”?？谇蛔儺愭溓蚓鷦t不同，它是口腔常駐菌群的一部分，雖然表達(dá)一定的病原因子（如產(chǎn)酸），與鄰近的細(xì)菌通過協(xié)同或拮抗的生態(tài)相互作用達(dá)到動態(tài)平衡，并非造成損害。在復(fù)雜的口腔微生物群中，并不是由單一一種細(xì)菌的行為決定整個復(fù)雜群落的行為，而是由口腔微生物群的相互作用來決定。當(dāng)與鄰近的產(chǎn)堿細(xì)菌一起作用時，變異鏈球菌對宿主可能并不具有病原性[6-7]。因此，目前普遍認(rèn)為，齲病并不是僅由變異鏈球菌或其他任何一種菌斑中的細(xì)菌單獨引起的，而是由各種產(chǎn)酸菌，如變異鏈球菌與生物膜中其他成員相互作用的結(jié)果。這個以群落和微生物生態(tài)為基礎(chǔ)的病原理論為理解牙菌斑與宿主健康或疾病的關(guān)系提供了新的視角，也為疾病預(yù)防及治療提供了新的手段。

多種屬群落可導(dǎo)致多重感染，多種細(xì)菌協(xié)同作用可致病。牙周病就是最好的例子。臨床研究提示，牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體和福賽斯坦納菌是成人牙周病生態(tài)中的致病聯(lián)合體。通過對牙周病發(fā)病機制的進(jìn)一步研究可以促進(jìn)對這種多重感染中不同毒力因子作用的認(rèn)識，為研究者提供發(fā)展針對多重感染的傳統(tǒng)診斷、預(yù)防及治療措施的重要信息。

口腔具有復(fù)雜的多種屬微生物群落。在形成生物膜結(jié)構(gòu)、執(zhí)行生理功能和導(dǎo)致微生物致病的過程中，群落成員間應(yīng)具有廣泛的相互作用。這些相互作用包括營養(yǎng)競爭、生存的協(xié)同作用、拮抗作用、毒力因子的中和作用、生長依靠信號機制干擾等。

3 口腔微生物群相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)

營養(yǎng)供給是決定口腔微生物群組成的一個重要因素。要適應(yīng)特殊的環(huán)境，如口腔，微生物發(fā)展出了可以有效利用這種生態(tài)微環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑[8-10]?？谇晃⑸锶旱臓I養(yǎng)物質(zhì)來源于食物的周期性攝入、唾液、其他微生物的代謝產(chǎn)物，以及菌斑中的多糖。當(dāng)人類膳食中具有大量蔗糖時，變異鏈球菌相對于其他細(xì)菌可能會具有一種競爭優(yōu)勢。變異鏈球菌比其他細(xì)菌更高效地代謝蔗糖，將蔗糖快速轉(zhuǎn)化為乳酸，具有很強的耐酸性。變異鏈球菌將蔗糖轉(zhuǎn)化為黏性葡聚糖分子的能力也促進(jìn)其對牙齒的黏附。缺乏這種能力的細(xì)菌則會被葡聚糖無差別捕獲，并參與菌斑的發(fā)育。

牙齦卟啉單胞菌是牙周病的主要病原因素之一，常常與其他牙周病原菌如中間普雷沃菌、具核梭桿菌、福賽斯坦納菌及齒垢密螺旋體共存。Grenier和Maryrand研究證實了牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體的營養(yǎng)共生。在共同培養(yǎng)中，牙齦卟啉單胞菌可以通過代謝齒垢密螺旋體產(chǎn)生的琥珀酸鹽來促進(jìn)自身的生長。牙齦卟啉單胞菌分泌的異丁酸也可刺激齒垢密螺旋體的生長。Yoneda等[11]近期研究證實，具核梭桿菌和福賽斯坦納菌的細(xì)胞提取物可以刺激牙齦卟啉單胞菌的生長，具體的生長刺激因子尚未鑒別。

口腔微生物的另一個重要營養(yǎng)來源就是唾液及齦溝液中的蛋白質(zhì)，由宿主組織及細(xì)菌產(chǎn)生。當(dāng)唾液蛋白質(zhì)成為有限的營養(yǎng)來源之一時，能夠水解蛋白質(zhì)的微生物便具有競爭優(yōu)勢。對齦下菌斑中的細(xì)菌來說尤其如此，革蘭陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌可以穩(wěn)定定植于該區(qū)域并導(dǎo)致牙周炎的原因之一與其高度的蛋白水解作用有關(guān)。當(dāng)其他蛋白水解能力相對較弱的細(xì)菌與牙齦卟啉單胞菌共生于生物膜中時，亦可受益于其他細(xì)菌的蛋白水解活動。因此，可以預(yù)計具有這種共生關(guān)系的微生物在生物膜中是應(yīng)該緊密相鄰的。

牙菌斑生物膜中兩種生物間的協(xié)同或互惠作用對唾液的依賴已經(jīng)由內(nèi)氏放線菌和口腔鏈球菌證實。在唾液包被表面，任何一種細(xì)菌單獨定植都很困難，可是兩者一起卻可以在同一表面上形成廣泛的生物膜。這可能是由于兩者對唾液成分聯(lián)合代謝作用的結(jié)果。

4 影響口腔微生物群相互作用的主要代謝產(chǎn)物

一種生物的代謝產(chǎn)物很可能對同一生物膜中種群間產(chǎn)生影響。具有較高比例的變異鏈球菌菌斑往往血鏈球菌的水平會被抑制。前者可將蔗糖代謝為乳酸，這是細(xì)菌代謝酸中酸性最強的一種。相對于血鏈球菌，變異鏈球菌具有更強的耐酸性，乳酸更有利于變異鏈球菌的生存[12]。血鏈球菌則可以代謝產(chǎn)生過氧化氫，這是一種非特異性抗菌劑，對包括變異鏈球菌在內(nèi)的其他共生菌具有拮抗作用，因為它們沒有能有效代謝這種有毒物質(zhì)的系統(tǒng)。許多厭氧菌，包括與人體牙周病相關(guān)的細(xì)菌也對氧化物敏感。因此，血鏈球菌水平相對較高的菌斑，變異鏈球菌水平及牙周炎相關(guān)菌如牙齦卟啉單胞菌水平則較低。而且牙菌斑中血鏈球菌的存在與牙周致病菌低水平相關(guān)，有助于口腔健康。

一種生物的代謝產(chǎn)物也可以促進(jìn)種群間的生長。變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸可以被韋榮球菌穩(wěn)定代謝。韋榮球菌存在于菌斑形成的早期。最近有研究發(fā)現(xiàn)，寡發(fā)酵鏈球菌亦可代謝變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸。寡發(fā)酵鏈球菌最初從無齲人體口腔中分離，其在菌斑中的數(shù)量增加與變異鏈球菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。這種非致齲鏈球菌還能抑制變異鏈球菌的生長。這種抑制作用的機制非常獨特。寡發(fā)酵鏈球菌通過乳酸酶的作用將變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸（這種在通常情況下是生長抑制劑的物質(zhì)）轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫則對變異鏈球菌具有高度毒性。

口腔微生物群之間存在合作代謝現(xiàn)象。一些種屬的細(xì)菌可以改變局部微環(huán)境，使其有利于其他種屬細(xì)菌的生長。具核梭桿菌和中間普雷沃菌可以在pH5.0～7.0的較寬范圍內(nèi)生存，牙齦卟啉單胞菌則不能在pH低于6.5的環(huán)境中生存。Takahashi[13]近期研究表明，使用谷氨酸和天門冬氨酸者兩種唾液中的主要氨基酸作為飼養(yǎng)底物，具核梭桿菌和中間普雷沃菌可以產(chǎn)生有機酸和氨，使菌斑環(huán)境接近中性，使pH值即使在產(chǎn)乳酸細(xì)菌和可發(fā)酵糖類存在的情況下也不至于劇烈下降，可保護酸敏感細(xì)菌如牙齦卟啉單胞菌免予酸攻擊。

微生物代謝中產(chǎn)生的氧氣、二氧化碳等氣體可以影響生物膜細(xì)菌相互作用。一些牙周病細(xì)菌在內(nèi)的高度厭氧菌需要在高厭氧環(huán)境下方能增殖。因此，可以代謝氧氣的細(xì)菌有利于周圍厭氧菌的生存。除了使環(huán)境保持中性有利于牙齦卟啉單胞菌生存外，具核梭桿菌還可以形成其生存所必需的嗜二氧化碳微環(huán)境。雖然具核梭桿菌與牙齦卟啉單胞菌都是厭氧菌，但其對氧氣的耐受能力差別很大。牙齦卟啉單胞菌對氧氣非常敏感，但具核梭桿菌可以耐受20%的氧氣含量[14]。有趣的是，當(dāng)在恒化培養(yǎng)基中與具核梭桿菌一起培養(yǎng)時，牙齦卟啉單胞菌甚至能在含20%氧氣的氣體環(huán)境中進(jìn)行生長。這很可能是由于具核梭桿菌活躍的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide－reduced，NADH）氧化酶/過氧化物酶的作用，使其能夠代謝氧分子和過氧化氫，為牙齦卟啉單胞菌形成了理想的厭氧環(huán)境。同時，具核酸桿菌還能為牙齦卟啉單胞菌提供生長所需的二氧化碳。

5 細(xì)菌素對口腔微生物群的作用

細(xì)菌可以產(chǎn)生對其他細(xì)菌具有特異性或非特異性作用的產(chǎn)物，如細(xì)菌素。細(xì)菌素是所有主要種系的細(xì)菌都可產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素。與抗生素不同，細(xì)菌素的殺菌譜較窄，只對相關(guān)細(xì)菌起作用?？谇绘溓蚓a(chǎn)生細(xì)菌素的能力最強。許多口腔鏈球菌都可以產(chǎn)生肽類細(xì)菌素。變異鏈球菌至少可以產(chǎn)生5種細(xì)菌素[15]：變鏈素Ⅰ至Ⅴ。變鏈素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ屬于含羊毛硫氨酸的乳鏈菌肽，抗菌譜相對較寬，變鏈素Ⅳ、Ⅴ則是未修飾的非乳鏈菌肽，變鏈素Ⅳ對緩癥鏈球菌家族成員作用特別活躍。一項最近的變異鏈球菌UA159菌株基因組研究表明,其含有至少9個變鏈素編碼推定基因，提示了變異鏈球菌可作用于其競爭者的全部手段或“武器儲備”[16]。許多研究提示，變鏈素的作用與變異鏈球菌在口腔生物膜中的普遍存在及成功定植是相關(guān)的。一些細(xì)菌素也可抑制血鏈球菌的生長，這可能是變異鏈球菌水平較高的菌斑中血鏈球菌水平較低的原因之一。因此，一些生物膜成員的細(xì)菌素表達(dá)可能決定了其共生菌的種類。

細(xì)菌素也可通過作為信號分子相似物發(fā)揮作用來影響種群間的相互作用[17]。釀膿鏈球菌和唾液鏈球菌產(chǎn)生的羊毛硫細(xì)菌素在結(jié)構(gòu)上彼此相似，并可與彼此的雙組分信號系統(tǒng)相互作用。這兩種細(xì)菌均可在黏膜表面定植，并通過拮抗生長依賴性信號傳導(dǎo)抑制對方的生長。因此，共生的唾液鏈球菌和以阻止具有毒力的釀膿鏈球菌形成生物膜。

其他的抗微生物成分也可對一些細(xì)菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生作用。這類物質(zhì)包括生長抑制因子。在亞致死濃度下，沒有觀察到它們對信號傳導(dǎo)的作用。這種相互作用就可以影響有毒力的生物膜依賴基因的表達(dá)。

許多口腔微生物都能使用細(xì)菌素樣成分與其他種屬的細(xì)菌競爭[18]。Teanpaisan等[18]使用瓊脂覆蓋及擴散的方法證實，44種從牙周部位分離的產(chǎn)黑色素厭氧菌，包括牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌，變黑普雷沃菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素樣物質(zhì)并對其敏感。分離并鑒定了變黑素的遺傳決定因素——一種由變黑普雷沃菌產(chǎn)生的4.1×104經(jīng)典細(xì)菌素，對牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌，福賽斯坦納菌及放線菌屬均具有殺菌作用[19]。

其他口腔細(xì)菌的細(xì)菌素及細(xì)菌素樣作用已被廣泛報告和證實[20]，包括中間普雷沃菌、二氧化碳噬纖維菌、伴放線放線桿菌、流感嗜血桿菌、具核梭桿菌，嚙蝕艾肯菌。然而，它們的生化特性和遺傳決定因素尚未充分研究。齒垢密螺旋體基因組測序顯示其至少有3個潛在細(xì)菌素分泌系統(tǒng)，提示這個菌屬的細(xì)菌也可能具有細(xì)菌素分泌功能。

分子學(xué)和遺傳學(xué)最新研究[21]顯示，細(xì)菌素的產(chǎn)生受到嚴(yán)格的調(diào)控，受細(xì)胞密度、營養(yǎng)供給、pH等環(huán)境因素以及遺傳因素的共同影響。這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)使得細(xì)菌素在恰當(dāng)?shù)臅r間和部位產(chǎn)生，以有效地在口腔微生物群落生態(tài)平衡中發(fā)揮作用。

人體口腔微生物群的穩(wěn)定只有在同一生物環(huán)境中的不同種群間達(dá)到生態(tài)平衡才能獲得，往往是生物群落中生態(tài)活動的結(jié)果[22]?？谇患?xì)菌產(chǎn)生并對細(xì)菌素和細(xì)菌素樣物質(zhì)敏感，使得細(xì)菌能夠選擇自己的“鄰居”，促進(jìn)了特定種屬細(xì)菌群落的建立，并在口腔生態(tài)系中微生物群落之間的生態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用。

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