翁海波，王志強，敬蔚然

（鄭州大學(xué)生物工程系，河南 鄭州 450001）

能源是人類社會賴以生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著世界人口的增加以及各國工業(yè)化水平的提升，整個社會對能源的需求量與日俱增。應(yīng)用生物能源轉(zhuǎn)化技術(shù)可將生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榍鍧嵞茉矗芫徑馐?、天然氣等不可再生化石能源日漸枯竭帶來的能源壓力。目前生物轉(zhuǎn)化使用的原料是玉米等糧食作物，但是這些原料的大量使用會影響到糧食安全，所以秸稈、麩皮、鋸木粉等農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢棄物等含有大量的木質(zhì)纖維素，將是很有潛力的乙醇發(fā)酵原料。另外，生物燃料的生產(chǎn)過程中，纖維素的預(yù)處理和纖維素酶的生產(chǎn)成本較高[1-2]。因此減少預(yù)處理，增強纖維素酶的活性，提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度，減少中間環(huán)節(jié)也是降低生產(chǎn)成本的途徑。

聯(lián)合生物加工（consolidated bioprocessing，CBP）不包括纖維素酶的生產(chǎn)和分離過程，而是把糖化和發(fā)酵結(jié)合到由微生物介導(dǎo)的一個反應(yīng)體系中，因此與其他工藝過程相比較，底物和原料的消耗相對較低，一體化程度較高[3]。本文主要討論CBP的概念，可行性和策略，以及真菌的應(yīng)用和發(fā)展前景。

1 CBP的可行性和必要性

應(yīng)用聯(lián)合生物加工是可行的。有關(guān)熱纖梭菌利用纖維素的研究為CBP可行性提供了實驗證據(jù)。生理學(xué)研究和14C標(biāo)記的纖維素實驗說明，生長于纖維素上的微生物的生物能量效益取決于胞內(nèi)低聚糖攝取過程中β-糖苷鍵磷酸解的效率，并且這些效益超過了纖維素合成的生物能量成本[3-4]。這些研究為纖維素分解菌在纖維素上快速生長提供了實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

以酶-微生物復(fù)合體存在比纖維素酶復(fù)合體單獨存在時纖維素酶的作用效率要高。在厭氧菌中，酶-微生物復(fù)合體的協(xié)同作用在降解纖維素時處于中心地位。然而，以產(chǎn)纖維素酶為特征的工業(yè)生產(chǎn)中卻不添加活體纖維素裂解菌。應(yīng)用以酶-微生物復(fù)合體為作用特征的CBP工藝將是必要的，是未來的研究方向。

2 CBP的策略

應(yīng)用聯(lián)合生物加工的關(guān)鍵是構(gòu)建出能完成多個生化反應(yīng)過程的酶系統(tǒng)，使纖維素原料通過一個工藝環(huán)節(jié)就轉(zhuǎn)變?yōu)槟茉串a(chǎn)品。一些細(xì)菌和真菌具有CBP所需要的特性，所以改造現(xiàn)有的微生物已成為研究的熱點。以基因重組等為代表的生物工程技術(shù)已經(jīng)使這種設(shè)想成為現(xiàn)實，并為設(shè)計出更完善的CBP酶系統(tǒng)提供了可能。對相關(guān)的微生物改造主要有以下3個策略。

2.1 天然策略

天然策略是將本身可產(chǎn)生纖維素酶的微生物，尤其是厭氧微生物進行改造，使其適應(yīng)CBP生產(chǎn)的要求。這種策略關(guān)鍵在于，提高對乙醇的耐受力，減少副產(chǎn)物的生成，導(dǎo)入新的代謝基因?qū)⑻腔a(chǎn)物全部或者大部分進行發(fā)酵，從而產(chǎn)出高濃度的乙醇。有研究者對耐乙醇嗜熱菌株的進行了篩選和改造[5]，所得的菌株能在60 g/L的乙醇濃度下生長，乙醇耐受性能滿足CBP工藝的要求。另外，對嗜熱菌和大腸桿菌來說，副產(chǎn)物如有機酸及其鹽抑制作用更強，缺少有機酸將會使乙醇的濃度顯著升高[6]。如敲除熱解糖梭菌的有機酸合成基因，結(jié)果未檢測到無機酸，而檢測到較高產(chǎn)量的乙醇[7]。另外通過電轉(zhuǎn)化的方法，在解纖維梭菌和熱纖維梭菌中，實現(xiàn)了異源纖維素酶基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。

2.2 重組策略

重組策略是通過基因重組的方法表達(dá)一系列的外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶等纖維素酶基因，使微生物能以纖維素為唯一碳源，將來源于纖維素的糖類完全或者大部分進行發(fā)酵。這方面的微生物有大腸桿菌，畢赤酵母，釀酒酵母等[8-9]。重組策略方面的研究取得了一定的成果。不同菌株所編碼糖苷水解酶（如纖維素酶，半纖維素酶，β-D-半乳糖苷酶），木聚糖降解酶，阿拉伯糖降解酶的基因已經(jīng)被導(dǎo)入釀酒酵母。能在纖維素，半纖維素，纖維二糖，木聚糖，阿拉伯糖上生長的工程菌也有報道。

重組策略所遇到的問題有：（1）外源基因共表達(dá)對細(xì)胞的有害性。如在釀酒酵母中導(dǎo)入大量的外源基因可能導(dǎo)致基因表達(dá)不穩(wěn)定和對細(xì)胞表面產(chǎn)生其他不利影響。（2）需要在轉(zhuǎn)錄水平使外源基因適量表達(dá)。如在釀酒酵母中，里氏木酶的纖維二糖水解酶Ⅰ基因需要高水平表達(dá)以保證所需要的酶活性，但其他的一些外源基因不需要太高的表達(dá)。這需要研究如何利用酵母的調(diào)控蛋白，找到合適不同基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)量。（3）一些分泌蛋白可能折疊不正確。纖維素降解蛋白合成之后必須要正確折疊才能分泌并行使功能。未正確折疊的蛋白分泌后要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白降解，而且對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成壓力[10]。需要更進一步的了解酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解機制和非折疊蛋白反應(yīng)機制，以使所有的纖維素降解酶都能穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，正確地折疊，行使相應(yīng)的功能。

2.3 共培養(yǎng)策略

纖維素糖化液含有葡萄糖，麥芽糖，乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖等多種糖分，利用共培養(yǎng)法能提高發(fā)酵效率。共培養(yǎng)策略有兩層含義：一是指發(fā)酵液中存在的不同的類型的微生物，利用廣泛類型的糖類底物。例如將僅能利用己糖的熱纖維梭菌與能利用戊糖的微生物進行共培養(yǎng)。這能避免不同生物間的底物競爭，實現(xiàn)乙醇產(chǎn)量最大化。二是指存在不同特性的微生物相互協(xié)作，加強發(fā)酵效果。如Kohji Miyazaki等將好氧菌和厭氧菌共發(fā)酵，提供了發(fā)酵過程中的協(xié)同模型[11]。Shrestha等用白腐菌在37℃下，對玉米纖維進行1～3 d的預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)用釀酒酵母和白腐菌共培養(yǎng)發(fā)酵玉米纖維會產(chǎn)生更多的乙醇，每100 g玉米纖維產(chǎn)3 g乙醇[12]。建立穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系是個復(fù)雜的過程，要考慮培養(yǎng)基，生長條件，以及菌株間的代謝關(guān)系。穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體的標(biāo)準(zhǔn)是各種生物的生物量在傳代后不會有大的變化并且能夠至少傳代20次。

3 里氏木霉在CBP上的應(yīng)用研究

3.1 里氏木霉的特點

里氏木霉有兩個生物合成體系：一種是在有氧條件下產(chǎn)纖維素酶系統(tǒng)，另一種是厭氧條件下產(chǎn)乙醇的酶系統(tǒng)。它有多種優(yōu)點。（1）相對于其他的微生物，里氏木霉能產(chǎn)生更足量的酶。研究表明，以可溶性糖（葡萄糖和木聚糖）為底物，里氏木霉的乙醇產(chǎn)量低于其他真菌，但以纖維素為底物比其他的絲狀真菌的乙醇產(chǎn)量高[13]。這可能是由于里氏木霉有很強的分泌系統(tǒng)，并且能產(chǎn)生大量的纖維素降解酶。如細(xì)胞溶膠中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體能產(chǎn)生和分泌復(fù)雜結(jié)構(gòu)的酶，如纖維二糖水解酶Ⅰ，而細(xì)菌沒有這些分泌系統(tǒng)。（2）里氏木霉能在低成本的培養(yǎng)基上生長。（3）能利用木質(zhì)纖維素糖化產(chǎn)生的所有的糖類產(chǎn)乙醇。（4）里氏木霉能產(chǎn)β-D-葡（萄）糖苷酶將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，解除代謝初產(chǎn)物纖維二糖對纖維素酶活性的抑制[14]。里氏木霉的這種基本特征決定著它在CBP中將有廣泛的應(yīng)用。

3.2 提高乙醇產(chǎn)量的策略

3.2.1 提高乙醇耐受力 耐受乙醇要通過以下策略優(yōu)化：（1）乙醇耐受基因的鑒定和修飾。（2）導(dǎo)入其他基因。如釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶，乙醇脫氫酶來增強乙醇合成。（3）敲除副產(chǎn)物的相關(guān)基因。高濃度的乙醇能改變細(xì)胞膜上的受體蛋白，阻遏糖酵解和代謝循環(huán)，最終抑制細(xì)胞的生長和發(fā)酵。許多證據(jù)表明，乙醇耐受基因不是單一的基因，全轉(zhuǎn)錄工程提供了一個新方法。例如分別通過三種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的突變，釀酒酵母的乙醇耐受力有所提高[15]。

3.2.2 提高糖轉(zhuǎn)運效率 糖類不能自由地穿過細(xì)胞膜，微生物是通過特定的糖轉(zhuǎn)運蛋白來利用糖類，所以了解糖轉(zhuǎn)運機制是必要的。轉(zhuǎn)運蛋白作為培養(yǎng)基中糖濃度的“感受器”，可產(chǎn)生相應(yīng)的胞內(nèi)信號.不同的糖轉(zhuǎn)運蛋白在不同的濃度下行使功能，從而使微生物在較廣的范圍內(nèi)利用糖類。已有里氏木霉的糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究報道[16]，對轉(zhuǎn)運蛋白的深入研究，可以使轉(zhuǎn)運蛋白在低糖濃度下對糖類的親和力較高，使糖類更好的被利用?？梢杂心康牡靥岣咿D(zhuǎn)運蛋白的數(shù)量，可以表達(dá)多種糖類的轉(zhuǎn)運蛋白，以盡可能多的利用生物質(zhì)產(chǎn)生的糖類。

4 研究展望

隨著化石能源的減少，尋求清潔能源將是未來的普遍做法。利用乙醇作為清潔燃料將會帶來經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。目前我國的乙醇主要由甘蔗、玉米等糧食生產(chǎn)，因此受到原料價格和來源上的限制。CBP具有明顯降低乙醇生產(chǎn)成本的潛力，越來越多的文獻也證明了其可行性，為低成本生產(chǎn)乙醇提供了有效的工藝。纖維素降解菌里氏木霉能夠分泌一系列酶將木質(zhì)纖維素分解為糖，并能最終發(fā)酵為乙醇。在這方面的研究必將使低成本的生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化技術(shù)實現(xiàn)跨越式的發(fā)展，并帶來可觀的社會效益。

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