何凡，何志義，李蕾，秦雪，鄧淑敏，劉芳，阮杏林，馮程程

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110016）

近年來，干細(xì)胞移植作為一種不同于傳統(tǒng)治療的全新方法，能重塑受損的神經(jīng)元通路和改善神經(jīng)功能缺失而成為缺血性腦血管病治療方面的研究熱點［1］。用于治療缺血性腦血管病的干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSC）。神經(jīng)干細(xì)胞來源于人的腦組織或人胚胎干細(xì)胞，受醫(yī)學(xué)倫理限制，不適合自體移植。MSC更適合用于缺血性腦血管病的干細(xì)胞移植治療［2～4］。而MSC移植入體內(nèi)后的低成活率限制了其應(yīng)用。Chen等［5］研究發(fā)現(xiàn)，MSC的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在體外可高達(dá)80%，而在體內(nèi)僅約為3%～10%，其原因雖然復(fù)雜，但主要是MSC移植至體內(nèi)后，其自身發(fā)生凋亡所致。因此，如何減少其移植后凋亡的發(fā)生，提高M(jìn)SC在體內(nèi)的存活率及向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的能力是目前干細(xì)胞移植治療腦缺血亟待解決的問題。

B cell lymphoma/leukemia gene 2（Bcl-2）是目前研究較為明確的抗凋亡基因。本研究擬采用慢病毒法將Bcl-2轉(zhuǎn)導(dǎo)入MSC中，旨在增加MSC對Bcl-2的表達(dá)，提高M(jìn)SC的存活率，為進(jìn)一步解決MSC在體內(nèi)凋亡率高的問題打下堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Gateway?BP ClonaseTMII Enzyme Mix、Gateway?LR ClonaseTMIIPlusEnzymeMix、LipofectamineTM2000、Opti-MEM I Reduced Serum Medium 均 購 自invitrogen公司。普TRI REAGENT購自美國MRC。RQ1 RNase-Free DNase購自美國Promega。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自美國 Fermentas公司。Puromycin、Polybrene、B-ME（2-巰基乙醇）購自Sigma公司。通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒購自TIANGEN公司。Neomycin、D/F12購自Gibco公司。F344大鼠間質(zhì)干完全培養(yǎng)基、PBS、消化胰酶購自Cyagen公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。F344大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Bcl-2慢病毒載體構(gòu)建及鑒定：根據(jù)小鼠Bcl-2序列設(shè)計引物，在5′端分別加上attB1和attB2位點，上下游引物分別為：5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGCAAGCCGG GAGAAC 3′與 5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTTCACTTGTGGCCCAGGTATG 3′以 小 鼠cDNA為模板，以上述設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過電泳檢測后進(jìn)行回收，純化。BP結(jié)合反應(yīng)-構(gòu)建pDOWN-mBcl-2載體。將BP反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)One Shot OmniMAXTM2 T1 Phage-Resistant CellsE.coli株中。LR結(jié)合反應(yīng)-構(gòu)建pLV/EXPN2-Puro-EF1A-mBcl2表達(dá)載體，將LR反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)One Shot?Mach1TMT1R Chemically CompetentE.coli株中。篩選出重組子后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序檢測。

1.2.2 Bcl-2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠間質(zhì)干細(xì)胞及鑒定：轉(zhuǎn)導(dǎo)前1 d（第1天），按照合適的細(xì)胞數(shù)量把細(xì)胞接種到6孔板中，使轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天的細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%；轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天（第2天），融解攜帶mBcl-2慢病毒濃縮液；去除培養(yǎng)液，加入1 ml F344大鼠間質(zhì)干完全培養(yǎng)基和100 μl的mBcl-2慢病毒濃縮液；每孔細(xì)胞可加入Polybrene促進(jìn)病毒感染細(xì)胞（終濃度6 μg/mL），放置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)導(dǎo)8 h后，去除含有病毒的培養(yǎng)液，并加入新鮮的完全培養(yǎng)液。放置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后，去除含有病毒的培養(yǎng)液，并加入含有Puromycin（4 μg/mL）的完全培養(yǎng)液來篩選被穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。放置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后Bcl-2的表達(dá)。

1.2.3 Bcl-2 Rat F344 MSC抗凋亡檢測：分別準(zhǔn)備T75瓶F344MSC及Bcl-2/F344 MSC，待細(xì)胞約80%～90%匯合時分別傳至6孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)約24 h，至孔內(nèi)細(xì)胞約90%以上匯合。參照Zhu等的方法［6］通過血清和氧剝奪（serum and oxygen eprivation，SOD）方式建立MSC體外模擬缺血損傷的細(xì)胞模型。流式鑒定細(xì)胞凋亡率按試劑盒說明書進(jìn)行上機(jī)前操作，其中1孔做空白對照，1孔做Annexin-FITC單標(biāo)對照，1孔做PI單標(biāo)對照，剩1孔做實驗組，每組重復(fù)3次。

1.2.4 Bcl-2 Rat F344 MSC神經(jīng)誘導(dǎo)及檢測：復(fù)蘇的Bcl-2 F344 MSC傳代，按照1∶2傳代1次，用于做神經(jīng)誘導(dǎo)；細(xì)胞傳到6孔板中，所有的細(xì)胞按照基本相同的密度接種；細(xì)胞在50%～60%匯合時，加入1 mmol/L β-ME（DMEM-20%FBS）處理 24 h，進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；換液前用PBS洗滌3次，洗去FBS，加入5mmol/L β-ME（DMEM-0%FBS）誘導(dǎo)5～6 h。本實驗選取NSE和Vimentin作標(biāo)記。以Gapdh基因作為內(nèi)參。神經(jīng)元特異型烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE），作為神經(jīng)元的標(biāo)記。波形蛋白（Vimentin）作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，RT-PCR法檢測NSE和Vimentin的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因的MSC的篩選及Bcl-2基因的檢測

轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2的MSC用Puro篩選，作用3 d后呈現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)過的F344大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的存活細(xì)胞明顯多于野生型F344大鼠。Puro作用8 d后，細(xì)胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。與陰性對照相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)過的F344大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的存活細(xì)胞明顯多于野生型F344大鼠。Puro作用8 d后撤藥，換成正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，各個藥物濃度篩選過的細(xì)胞繼續(xù)生長，完成抗藥性細(xì)胞篩選。RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因的表達(dá)情況見圖1。

2.2 SOD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測（圖2）

Bcl-2/F344MSC早期細(xì)胞凋亡率為（18.95±2.57）%，F(xiàn)344 MSC 早期細(xì)胞凋亡率為（30.87±5.69）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 神經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞RT-PCR結(jié)果

細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)后有較多成球形細(xì)胞，但是大部分細(xì)胞為短梭形貼壁增殖；誘導(dǎo)后細(xì)胞成球形和拉絲回縮明顯，細(xì)胞貼壁性下降明顯有懸浮的趨勢。結(jié)果顯示無論經(jīng)過誘導(dǎo)或者沒經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞都表達(dá)NSE和Vimentin。經(jīng)過對電泳條帶的光密度測量，經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)NSE的量比沒經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)NSE的量要大近1倍。而Vimentin的表達(dá)量在這兩種細(xì)胞中基本沒差別（圖3）。

3 討論

MSC具有貼壁生長的特性，且體外培養(yǎng)能夠不斷的分裂和增殖，遺傳性能穩(wěn)定，易于進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)染及蛋白的表達(dá)［7］。Bcl-2是Tsujimoto等從濾泡性淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因，能對抗多種原因引起的細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是能夠抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生的“抗凋亡基因”。盡管Bcl-2最初是作為一種原癌基因被認(rèn)識的，但它對正常細(xì)胞的增殖和分化沒有影響，不會導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化而發(fā)生癌變。因此Bcl-2可作為外源性基因轉(zhuǎn)染MSC，起到基因及干細(xì)胞治療的雙重作用。最近Li等［8］將Bcl-2基因修飾的MSC移植入心肌梗死大鼠模型，發(fā)現(xiàn)Bcl-2能夠增加移植后的MSC的存活率，并且不影響MSC的多向分化潛能，心肌梗死灶周圍的毛細(xì)血管密度增加15%，心肌梗死病灶縮小17%，心肌功能得到明顯改善。目前常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和病毒載體法，常用的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。慢病毒與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法均為高效轉(zhuǎn)基因方法，可使目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入載體細(xì)胞的基因組中，并持續(xù)表達(dá)目的基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法依賴細(xì)胞分裂周期，而慢病毒載體法并不依賴細(xì)胞分裂周期。因此本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞株。

在MSC移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中對腦缺血的治療研究最多。導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死的腦缺血惡劣的病理生理環(huán)境必然對MSC存活及發(fā)揮其治療功效構(gòu)成極大的威脅。本研究參照Zhu等的方法［6］以SOD處理來模擬腦缺血，結(jié)果顯示SOD可誘導(dǎo)MSC的凋亡。經(jīng)Bcl-2基因轉(zhuǎn)染的MSC的凋亡明顯減少，存活細(xì)胞明顯增加，這說明Bcl-2基因轉(zhuǎn)染對MSC體外模擬缺血性損傷有保護(hù)作用，攜帶有Bcl-2基因的細(xì)胞抗凋亡能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。使Bcl-2基因修飾的MSC移植治療腦缺血而發(fā)揮其更大治療效應(yīng)成為可能。

MSC是來源于骨髓的一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，不僅可以分化為骨、軟骨、脂肪等間質(zhì)細(xì)胞，在適宜的條件下，還能分化為神經(jīng)細(xì)胞［9］。本研究提示，轉(zhuǎn)導(dǎo)了Bcl-2基因的MSC仍具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。說明轉(zhuǎn)導(dǎo)了Bcl-2基因的MSC在基因治療過程中，仍能發(fā)揮其干細(xì)胞的作用。本實驗只作為F344MSC-mBcl2/eGFP向神經(jīng)細(xì)胞分化能力的檢測，經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)NSE較多，可能與其自身抗凋亡能力強(qiáng)，細(xì)胞存活時間長有關(guān)。轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因后，提高了MSC在體內(nèi)的存活率及向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的能力，從而為下一步Bcl-2基因修飾的MSC移植治療腦缺血的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

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