王秀霞，王天任，何麗霞，孔琳，徐小延，楊大磊

（中國醫(yī)科大學 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

體外受精-胚胎移植技術誕生已經(jīng)30余年，雖然其臨床妊娠率在逐漸增高，但仍停留在40%左右，即在接受治療的患者中仍然有一半以上不能成功妊娠，即使妊娠的患者也存在高于自然的流產(chǎn)率，實際抱嬰回家率僅有25%左右，因此探討影響體外受精-胚胎移植臨床妊娠的因素及預測指標對于提高其成功率具有重要的意義。前期研究結果顯示，卵泡液中NK細胞百分比及活化NK細胞百分比增加與體外受精-胚胎移植助孕治療的不良妊娠結局相關［1］。細胞因子白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素 12（interleukin-12，IL-12）和白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）均有較強的活化 NK 細胞的作用，而且研究證明，在自然妊娠婦女外周血中IL-2、IL-12 和 IL-18 的水平與不良妊娠結局相關［2，3］，但其與體外受精-胚胎移植妊娠結局的關系尚未見報道。本文檢測了卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平并探討其與妊娠結局的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年7月至2009年4月在我院輔助生殖中心接受體外受精-胚胎移植助孕治療的不孕癥患者117例，年齡在35歲以下，不孕原因為單純輸卵管阻塞，所有對象均排除其他內(nèi)分泌疾病，無心、肝、腎等疾病，近3個月來未應用激素類藥物，進入周期前所有化驗指標均為正常，基礎促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平<10 mIU/L。

1.2 研究方法

1.2.1 超排卵方案：117例研究對象均采用常規(guī)長方案，于上一個月經(jīng)周期的黃體高峰期（即月經(jīng)周期21 d左右）肌注促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone agonist，GnRH-a，商品名達菲林，易普生公司提供），于本周期月經(jīng)來潮的第3天應用FSH（商品名果那芬，瑞士雪蘭諾公司提供），每日1次，具體劑量根據(jù)患者情況150～225 IU不等，皮下注射。持續(xù)至卵泡成熟，當有3個卵泡直徑≥16 mm，或1個≥18 mm、2個≥16 mm時，結合患者血中激素水平給予人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG，麗珠公司提供）注射，常規(guī)為5 000～10 000 IU，注射后34～36 h取卵。

1.2.2 卵子回收和卵泡液的采集和保存：采用B超引導下經(jīng)陰道取卵術，選擇直徑≥16 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液，排除空卵泡的卵泡液，立即以500g離心10 min，取上清液分裝于冷凍管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。收集記錄患者的詳細資料，包括患者年齡、本周期獲卵數(shù)、子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度以及妊娠結局等。所有標本的采集均得到本院倫理委員會的通過并征得患者本人同意。

1.2.3 IL-2、IL-12和IL-18水平的測定：應用雙抗體夾心酶標免疫分析法檢測卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的水平，人ELISA試劑盒（96T）購自美國Bender公司。

1.3 統(tǒng)計分析

計量資料以±s表示，應用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，組間采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 妊娠組與未妊娠組患者基本特征的比較

117例接受體外受精-胚胎移植助孕治療的患者根據(jù)移植后14 d血HCG水平確定生化妊娠，HCG<20 mIU/ml者為未妊娠組，共58例；HCG>20 mIU/ml、第35天B超下見到原始心血管搏動為妊娠組，共59例。兩組患者的年齡、血清激素水平、促排卵所用藥物劑量、獲卵數(shù)等指標無顯著差異，具有可比性（表 1）。

表1 妊娠組與未妊娠組基本特征比較（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

表1 妊娠組與未妊娠組基本特征比較（±s）Tab.1 General items between pregnancy group and non-pregnancy group（±s）

Item Pregnancy group（n=59） Non-pregnancy group（n=58） P Age（year） 29.56±3.15 29.83±3.01 0.64 Basal FSH（mIU/ml） 7.09±1.64 7.28±1.65 0.54 FSH duration（day） 9.47±1.96 9.16±2.06 0.39 FSH dosage（IU） 2 085.0±592.5 1 995.0±504.8 0.38 Endometrial thickness on HCG day（mm） 11.12±2.17 10.57±2.19 0.18 Numbers of oocyte retrieved（n） 12.66±7.59 11.93±6.31 0.57

2.2 妊娠組與未妊娠組患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18水平的比較

未妊娠組卵泡液中IL-2的濃度為（40.89±22.83）pg/ml，高于妊娠組的（36.73±18.53）pg/ml，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。未妊娠組卵泡液中IL-12的濃度為（1.59±1.58）pg/ml、IL-18的濃度為（131.8±162.35）pg/ml，高于妊娠組的 IL-12 （0.52±0.88）pg/ml和 IL-18（76.10±69.06）pg/ml，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。

3 討論

眾所周知，T淋巴細胞有Th1和Th2兩個亞群，Th1型淋巴細胞主要是細胞毒的殺傷作用，Th2型淋巴細胞主要是免疫保護作用，兩者通過各自分泌的細胞因子調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能。成功妊娠的建立和維持需要Th1和Th2功能的平衡，Th1型淋巴細胞功能占主導時，可導致妊娠失敗。前期研究結果顯示，卵泡液中活化NK細胞濃度和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）濃度的增加均與體外受精-胚胎移植臨床妊娠失敗相關，而TNF-α與卵丘顆粒細胞凋亡相關［4］。細胞因子IL-2和IL-12是Th1型主要細胞因子，IL-18是重要的炎性細胞因子，是Th1細胞的輔助因子，三者均具有刺激NK細胞活化、分泌IFN-γ等細胞因子、發(fā)揮細胞毒的作用。研究證明，習慣性流產(chǎn)患者血中上述3種細胞因子水平均增加，提示其參與胚胎的免疫耐受，在妊娠調(diào)節(jié)方面具有重要作用，因此其在體外受精-胚胎移植中的作用受到了關注［2，3］。

Ledee等［5］檢測了卵泡液中細胞因子水平和其對應的卵子發(fā)育狀態(tài)兩者間的相關性，結果顯示卵泡液中IL-2的濃度與胚胎早期卵裂相關，表明IL-2對于早期胚胎發(fā)育可能起到促進作用，而IL-12水平則與胚胎碎片率有關。另有研究顯示卵泡液中IL-12與卵細胞成熟及受精相關，IL-12濃度越高，成熟度越差，受精率越低，因此提出卵泡液中IL-12水平可作為預測體外受精-胚胎移植陰性結局的指標［6，7］。Ledee-Bataille［8］探討了接受體外受精-胚胎移植患者取卵日宮腔分泌物中IL-18水平，結果顯示含量高者妊娠率低；Gutman等［9］證實了卵泡液中存在IL-18，并認為體外受精-胚胎移植患者超排卵周期卵泡液中IL-18濃度比自然周期增高，并證實發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的患者成熟卵泡IL-18濃度高于未發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的患者。但其與體外受精-胚胎移植臨床妊娠結局的關系尚未見報道。

本研究檢測了接受體外受精-胚胎移植妊娠與未妊娠患者卵泡液中IL-2、IL-12和IL-18的濃度，結果顯示卵泡液中IL-2濃度與臨床妊娠結局無相關關系，而IL-12和IL-18濃度均為妊娠組低于未妊娠組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。IL-2作為Th1細胞因子具有活化NK細胞、使其分泌IFN-γ的作用。前期研究結果顯示卵泡液中活化的NK細胞及卵泡液中IFN-γ與不良的妊娠結局相關，但本研究卻未獲得其與不良妊娠結局相關的結果。結合Ledee［5］研究的卵泡液中IL-2與胚胎早期卵裂相關，提示卵泡液中IL-2可能未發(fā)揮Th1因子的刺激NK細胞活化、繼之產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子而導致不良結局的作用，而是發(fā)揮了促進胚胎發(fā)育的積極作用。但其調(diào)節(jié)機制尚不清楚。如前所述，卵泡液中IL-12水平增高與胚胎質(zhì)量下降相關，推測在卵巢中各卵泡間存在滲透作用或某種誘因?qū)е赂髀雅菀褐蠭L-12增高，使所獲卵子質(zhì)量總體下降，進而影響胚胎種植，導致臨床妊娠失敗。此推論尚需對卵巢中不同卵泡液和卵巢動脈血中IL-12水平進行檢測才能證明。IL-18水平增高與不良的妊娠結局相關，推測是由于激活卵泡液中NK細胞，分泌細胞因子；而且在IL-12的協(xié)同作用下，IL-18具有促進體內(nèi)免疫向Th1方向轉(zhuǎn)化作用；最新研究顯示IL-18還能使γδT細胞增殖，使IFN-γ和TNF-α等細胞因子分泌增加［10］。經(jīng)此3種調(diào)節(jié)途徑使卵泡內(nèi)環(huán)境中Th1型細胞因子增加，導致卵母細胞發(fā)育不良以及滲透至子宮內(nèi)膜使種植窗條件改變，影響胚胎種植，最終導致妊娠失敗。此推論有待今后進一步研究。

探討細胞因子與體外受精-胚胎移植妊娠結局的關系，將為臨床應用藥物調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫狀態(tài)、改善臨床妊娠結局提供理論基礎和監(jiān)測指標，對提高體外受精-胚胎移植臨床妊娠率具有重要意義。

［1］王秀霞，張合龍，何麗霞，等.卵泡液中NK細胞及其活化與體外受精結局關系的探討［J］.中國醫(yī)科大學學報，2009，38（10）：770-772.

［2］Hadinedoushan H，Mirahmadian M，Aflatounian A.Increased natural killer cell cytotoxicity and IL-2 production in recurrent spontaneous abortion［J］.Am J Reprod Immunol，2007，58（5）：409-414.

［3］Wilson R，Jenkins C，Miller H.Abnormal cytokine levels in nonpregnantwomenwithahistoryofrecurrentmiscarriage［J］.EurJObstet Gynecol Reprod Biol，2004，115（1）：51-54.

［4］王秀霞，易曉芳，何麗霞，等.卵泡液中腫瘤壞死因子α和γ干擾素水平對體外受精妊娠結局的影響［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科學雜志，2009，25（11）：859-860.

［5］Ledee N，Lombroso R，Lombardelli L，et al.Cytokines and chemokines in follicular fluids and potential of the corresponding embryo：the role ofgranulocytecolony-stimulatingfactor［J］.HumReprod，2008，23（9）：2001-2009.

［6］Coskun S，Uzumcu M，Jaroudi K，et al.Presence of leukemia inhibitory factor and interleukin-12 in human follicular fluid during follicular growth［J］.Am J Reprod Immunol，1998，40（1）：13-18.

［7］Gazvani MR，Bates M，Vince G，et al.Follicular fluid concentrations ofinterleukin-12andinterleukin-8inIVFcycles［J］.FertilSteril，2000，74（5）：953-958.

［8］Ledee-Bataille N，Olivennes F，Kadoch J，et al.Detectable levels of interleukin-18 in uterine luminal secretions at oocyte retrieval predictfailureoftheembryotransfer［J］.HumReprod，2004，19（9）：1968-1973.

［9］Gutman G，Soussan-Gutman L，Malcov M，et al.Interleukin-18 is high in the serum of IVF pregnancies with ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Am J Reprod Immunol，2004，51（5）：381-384.

［10］Li W，Yamamoto H，Kubo S，et al.Modulation of innate immunity by IL-18［J］.J Reprod Immunol，2009，83（1-2）：101-105.