豬鏈球菌2型福建分離株的主要毒力基因分析*

方勤美,黃紹謙,俞伏松,朱繼昌,林天龍

豬鏈球菌2型福建分離株的主要毒力基因分析*

方勤美,黃紹謙,俞伏松,朱繼昌,林天龍

目的為了解福建地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力因子分布情況。方法選取谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fbps)及毒力相關(guān)序列orf2等7個豬鏈球菌2型主要毒力基因,分別設(shè)計了7對引物,采用PCR方法,對本室分離保存的豬鏈球菌2型福建分離株的毒力基因進(jìn)行分析。結(jié)果從屠宰生豬體內(nèi)分離的4個豬鏈球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,另1株從生豬體內(nèi)分離的分離菌株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。結(jié)論福建地區(qū)生豬中豬鏈球菌2型至少有兩種毒力基因型。

豬鏈球菌2型;福建分離株;毒力基因

豬鏈球菌2型是一種重要的人獸共患病病原,不同的豬鏈球菌2型菌株的致病力存在明顯差異,而這種差異可能與各菌株的毒力因子分布情況有很大關(guān)系〔1〕。國內(nèi)外許多學(xué)者對豬鏈球菌2型的毒力因子分布與致病力之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。目前認(rèn)為豬鏈球菌2型的毒力因子主要包括谷氨酸脫氫酶(GDH)、莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)及毒力相關(guān)序列ORF2等。本研究選取了7對主要毒力基因引物進(jìn)行PCR檢測,以了解福建無癥狀生豬豬鏈球菌2型的毒力因子的分布情況,并與國內(nèi)毒力因子表型分布情況作比較,對福建分離株的基因型分布情況作初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 PFJ07分離自病豬淋巴結(jié),PFJ080820和PFJ080842分離自無癥狀生豬扁桃體,PFJ080913、PFJ080942和PFJ080943分離自無癥狀生豬鼻咽拭子,上述菌株經(jīng)本室2008年9月分離鑒定后保存。豬鏈球菌2型參考菌株(JA070109)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院陸承平教授惠贈。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 THB液體培養(yǎng)基和綿羊血平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,ExTaq酶、dNTP、DNA Marker(DL-2000)、蛋白酶 K 均購自TaKaRa公司,細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器PCR儀(Eppendorf,AG22331),臺式離心機(Thermo,PICO17),核酸電泳儀(Hoefer,HE33),自動凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,Gel DOC2000)。

1.4 引物合成 參照文獻(xiàn)〔2〕合成7對引物,其序列、退火溫度及擴增片度大小見表1,各引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

表1 PCR反應(yīng)引物及目的片段大小Table 1 The primer sequences and product size

1.5 模板制備 保存菌株先接種綿羊血平板,置37℃培養(yǎng)18 h后,挑取單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基,37℃靜置培養(yǎng)18 h。取各檢測菌種新鮮培養(yǎng)菌液1 mL離心棄上清,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作提取模板DNA,分裝,置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR反應(yīng)體系 PCR擴增均采用25 μ L反應(yīng)體系包括:10×PCR緩沖液(含25mmol/L MgCl2)2.5 μ L,10mmol/L dNTPs 2 μ L,上下游引物(10mmol/L)各0.6 μ L,ExTaq 酶(5U)0.15 μ L,模板 2 μ L,用去離子水調(diào)整終體積至25 μ L。反應(yīng)結(jié)束后各取5 μ L于1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

2 結(jié) 果

5株 SS2福建分離株,4株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,1株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+,實驗室從病豬分離的SS2PFJ07基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+(見表 2)。所有菌株的電泳圖見圖1至7。

以下各圖中:M.MarkerDL2000;1.PFJ080820;2.PFJ080842;3.PFJ080913;4.PFJ080942;5.PFJ080943;6.PFJ07;7.XT060821;8.空白對照.

3 討 論

豬鏈球菌2型并不都具有致病性,根據(jù)菌株致病力的差異,將其分為強致病力菌株、弱致病力菌株以及無致病力菌株。先前的研究發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2型致病力的差異與該菌株的毒力因子有著密切的聯(lián)系。Smith等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)通過插入突變得到的無莢膜的等位基因突變株在體外很容易被豬肺泡巨噬細(xì)胞攝入,更重要的是,通過鼻腔接種無菌仔豬的突變株對其完全無致病性,由此可見,莢膜多糖與細(xì)菌致病力有關(guān)。曾巧英等〔4〕研究證明MRP可單獨作為豬鏈球菌2型的毒力因子。由于M RP和EF在強毒株中檢出率很高,在非致病菌株中檢出率很低,因而MRP和EF常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型高致病性的標(biāo)志〔5〕。SLY 對Hep-2細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Vero細(xì)胞均具有一定的毒性作用,且經(jīng)純化后溶血素免疫的小鼠和豬均能耐受強毒株的攻擊,所以推測其可能是豬鏈球菌2型的一種重要的致病因子,也是一種保護(hù)性抗原〔6〕。然而,豬鏈球菌2型的溶血素基因分布具有很強的地域性,來自歐洲的大多數(shù)菌株能產(chǎn)生溶血素,而來自北美的菌株不產(chǎn)生溶血素,但仍然具有致病性〔1〕。據(jù)相關(guān)研究證實基于GDH蛋白的檢測可區(qū)分豬鏈球菌2型的強毒株、弱毒株和無毒株,同時,GDH也與豬鏈球菌的種屬有關(guān)〔7〕。De Greef A 等〔8〕用缺乏 FBPS 的突變株與野毒株同時共同感染無菌仔豬,結(jié)果表明FBPS在細(xì)菌定植某些靶器官的過程中起一定作用。毒力相關(guān)序列orf2在強弱毒株之間的序列存在差異,這種差異可能與菌株致病性有關(guān)〔9〕。

表2 豬鏈球菌2型的毒力因子檢測Table 2 The detection of virulent factor in SS2

了解福建地區(qū)豬鏈球菌2型分離株的毒力因子分布情況,有助于進(jìn)一步了解福建地區(qū)SS2分離株的毒力基因型,為豬鏈球菌2型的防控提供科學(xué)依據(jù)。因此本研究選取上述7種主要毒力因子,通過對福建地區(qū)豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行PCR檢測,研究發(fā)現(xiàn)從鼻咽拭子中分離的豬鏈球菌2型菌株都缺乏EF和SLY這兩個毒力因子,從扁桃體上分離的豬鏈球菌2型菌株有一株也缺乏以上兩種毒力因子,另一株同時具有7種主要毒力因子。豬鏈球菌2型菌株的毒力因子表型分布是否與其存在部位有一定的關(guān)系,還有待進(jìn)一步的研究。由于分離的菌株數(shù)量有限,因此福建地區(qū)生豬豬鏈球菌2型分離株的毒力基因型是否主要為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,還有待對更多生豬豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行檢測。

趙冉等〔10〕研究結(jié)果表明25株國內(nèi)致病性豬鏈球菌2型分離株,96%(24/25)具有上述7種毒力基因,僅一株缺失ef,提示我國目前SS2流行菌株的毒力基因型主要為同時具有上述7種毒力基因的基因型;李春玲等〔11〕研究結(jié)果也顯示我國健康豬豬鏈球菌扁桃體分離株毒力基因分布較為復(fù)雜,而且豬鏈球菌2型的優(yōu)勢流行菌株的毒力基因型為同時具有多種毒力基因的基因型。呂立新等〔12〕從健康生豬扁桃體中分離到一株同時含有上述7種毒力基因的豬鏈球菌2型。從上述可知本試驗從健康生豬扁桃體中分離的具有7種毒力基因的菌株的基因型為國內(nèi)優(yōu)勢基因型。據(jù)報道在國內(nèi)豬扁桃體分離株中也發(fā)現(xiàn)一些新的基因型cps2J+/mrp+/ef-/sly-、cps2J+/mrp+/ef+/sly-、cps2J+/mrp*/ef-/sly-和cps2J+/mrp-/ef-/sly-,而本研究從生豬體內(nèi)分離的其余4株豬鏈球菌2型與從福建地區(qū)病豬分離到的豬鏈球菌2型的基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+,因此其為新的基因型。本試驗結(jié)果表明福建地區(qū)生豬中豬鏈球菌2型至少有兩種毒力基因型。福建地區(qū)是否存在其它基因型還有待對更多的分離株進(jìn)行檢測。

〔1〕路玲玲,李蓉,鄭玉玲,等.2型豬鏈球菌毒力因子研究進(jìn)展〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(3):570-572.

〔2〕俞伏松,車勇良,郭長明,等.豬鏈球菌2型福建株的分離鑒定〔J〕.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,37(3):290-294.

〔3〕Smith H,Damman M,Van,Der,Velde J,et al.Identification and characterization of the cps locus ofStreptococcus suisserotype 2:the capsule protects against phagocytosis and is an important virulencefactor〔J〕.InfectImmun,1999,67(4):1750-1756.

〔4〕曾巧英,陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白誘導(dǎo)上皮細(xì)胞融合和凋亡〔J〕.微生物學(xué)報,2003,43(3):407-411.

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〔9〕李干武,姚火春,陸承平.在豬鏈球菌2型江蘇分離株中發(fā)現(xiàn)新的orf2毒力相關(guān)基因〔J〕.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2003,11(3):295-298.

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〔11〕李春玲,余煒烈,賈愛卿,等.豬鏈球菌扁桃體分離株的毒力因子分布特征與致病性〔J〕.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2009,31(2):104-109.

〔12〕呂立新,何孔旺,倪艷秀,等.從正常屠宰豬扁桃體中分離到致病性豬鏈球菌2型〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(4):379-383.

Genetic analysis on the main virulence genes in the Fujian strain ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs

FANG Qin-mei,HUANG Shao-qian,YU Fu-song,ZHU Ji-chang,LIN Tian-long

(Instituteof Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou350003,China)

To investigate the distribution of virulence associated factors of 5 strains ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province,7 virulence genes were detected through PCR amplification.They were the glutamate dehydrogenase gene(gdh),the capsular polysaccharides gene(cps),the extracellular factor gene(ef),the muramidate-released protein gene(mrp),the suilysin gene(sly),the fibronectin-binding protein gene(fbps)and the virulence-associated sequence or f2.Among these 5 strains isolated,the virulence genotypes of 4 strainsS.suistype 2 and strain SS2PFJ07 was gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+and the other one strain isolated from slaughtered pigs was gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+respectively.This results showed that there are at least 2 virulence genotypes in Streptococcus suis type 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province.

Streptococcussuistype 2;Fujian strain;virulence-associated gene

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

1002-2694(2010)01-0065-04

*福建省科技廳項目(2006F3024、2006NZ0003-2、2006N0021)

林天龍,Email:lint05@163.com

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,福州 350003

2009-08-07;

2009-10-20