γ-干擾素試驗及比較皮試在結核污染牛群的應用研究*

張喜悅,呼西旦,楊經緯,曹 瑞,黃保續(xù),范偉興

2.新疆牧科院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

γ-干擾素試驗及比較皮試在結核污染牛群的應用研究*

張喜悅1,呼西旦2,楊經緯1,曹 瑞1,黃保續(xù)1,范偉興1

目的引進了國外的牛結核病γ-干擾素試驗和比較變態(tài)反應,與我國常用單純頸部變態(tài)反應試驗進行比較,評價不同檢疫方法的優(yōu)缺點。方法5個結核污染牛群的167頭牛同時用牛結核病γ-干擾素試驗和比較變態(tài)反應進行檢測,其中的106頭牛用于其他變態(tài)反應方法的比對。結果167頭牛中,γ-干擾素試驗和國外比較變態(tài)反應檢出陽性符合數為89頭,陽性符合率為92.7%(89/96);106頭牛中,國產牛型結核菌素(PPD)檢與國外牛型PPD檢出的陽性符合數為78頭,陽性符合率為93.41%(78/83.5),國內常規(guī)皮試檢出陽性牛84頭,陽性率為79.25%(84/106),國外常規(guī)皮試檢出陽性牛66頭,陽性率為62.26%(66/106),國內比較變態(tài)反應與國外比較變態(tài)反應之間的陽性符合數為59頭,陽性符合率為92.19%(59/64)。結論證實γ-干擾素試驗和國外比較變態(tài)反應之間具有較好的陽性符合率,國內牛PPD與國外牛PPD試驗結果相似,但國內常規(guī)皮試的特異性很低,而將國內皮試改進為國內比較皮試,則與國外常規(guī)的比較皮試具有較好的陽性符合率。

牛結核;γ-干擾素;比較變態(tài)反應

牛結核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種牛的慢性消耗性傳染病,該病可以傳染給人類〔1〕。近年來,我國的牛結核疫情加重,嚴重威脅著人類的健康〔2〕。我國大多數牛場都是用單純的牛型提純結核菌素(PPD)頸部皮膚變態(tài)反應來進行牛結核檢疫的,如果結果是陽性,則要進行隔離或撲殺。但是很多被撲殺的陽性牛,沒有任何可見的病理變化,對牛結核檢疫造成了很大阻力。

在很多發(fā)達國家,通常使用比較變態(tài)反應和γ-干擾素試驗進行檢疫。比較變態(tài)反應在國外已經具有很長的應用歷史了,如英國、加拿大、美國、澳大利亞和新西蘭等國家〔3-7〕,均采用比較變態(tài)反應作為撲殺結核陽性牛的試驗依據,并有相關的法案規(guī)定強制執(zhí)行。牛全血干擾素試驗是牛結核診斷的一種新型的牛結核診斷方法,很多學者對其進行深入的研究。目前,該方法在歐盟和美國等發(fā)達國家已經得到了承認〔6-8〕,成為繼變態(tài)反應之外的唯一的法定活畜診斷試驗。我們將該方法引進中國,并與國際上通用的比較變態(tài)反應和我國常用的單純頸部牛型結核菌素PPD皮試進行比較,從而為改進我國的牛結核檢疫方法積累數據。

1 材料與方法

1.1 PPD與試劑盒 國產牛PPD購于黑龍江省生物制品一廠。比較變態(tài)反應試劑和 BOVIGAMTM牛結核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒均為荷蘭產品。

1.2 試驗用牛 中國西部地區(qū)5個大的牛群,用國標方法進行檢疫后,隔離陽性?；蚱渚o密接觸者,分別組成了5個新的牛結核隔離牛群,共計167頭活畜。

1.3 γ-干擾素試驗

1.3.1 抗原刺激 每頭牛采集5mL血液肝素抗凝血液,室溫下于30h內運送到實驗室。將采集的每份抗凝全血各取1.5mL加入3個不同孔中,然后取100μ L的牛型PPD、禽型PPD和陰性對照磷酸鹽緩沖液(PBS),分別加入至抗凝全血中,混勻后于含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16h。用移液器小心吸取培養(yǎng)的上清,轉入至1.5mL離心管中,即為刺激產生的 γ-干擾素上清。這些上清可以立即用ELISA進行檢測,也可以冷凍保存,待時間方便后再進行檢測。

1.3.2 牛γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

單抗包被板上每孔加入50μ L樣品稀釋液,然后加入50μ L待測樣品或對照,混勻后室溫作用1h;洗滌,每孔加入100μ L酶標抗體,室溫作用1h;洗滌后每孔加入100μ L底物,室溫避光作用 30min后,加入終止液,測定OD450nm值。當牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1是為陽性,反之為陰性。

1.4 國內單純頸部變態(tài)反應試驗 參照依據中華人民共和國國家標準《動物結核病診斷技術(GB/T 18645-2002)》進行,僅用牛型PPD在牛頸部進行變態(tài)反應試驗,劑量為2000國際單位(IU),注射前測量皮膚厚度,注射后72h再次測定皮膚厚度,皮厚差大于3mm時判為陽性,反之為陰性。

1.5 國外進口試劑比較變態(tài)反應試驗 在牛頸部同時注射國外的牛型和禽型PPD,國外牛型PPD注射方法參照國標方法進行,國外禽型PPD注射位點在牛型PPD下方間隔越10～15cm處。注射前要先剪毛,在牛型和禽型PPD注射位點處均要測定皮膚厚度。72h后,在牛型和禽型PPD注射位點處均要重新測定皮膚厚度。如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超過3mm判為陽性,反之為陰性。牛型和禽型PPD使用劑量均為2000IU。1.6 γ-干擾素檢測方法與國外比較變態(tài)反應的比對試驗 167頭牛同時用國外比較變態(tài)反應和γ-干擾素試驗對其進行檢測。比較這2種方法的敏感性和特異性。

1.7 γ-干擾素檢測方法與牛型PPD單純頸部變態(tài)反應的比對試驗 167頭牛均同時進行了γ-干擾素檢測試驗和比較變態(tài)反應試驗。單獨計算比較皮試中牛型PPD的72h皮厚差,作為牛型PPD單純頸部變態(tài)反應,按照國家標準判定結果,并與γ-干擾素檢測方法進行比較。

1.8 其他變態(tài)反應之間的比對試驗 167頭牛中的106頭牛,用于其他變態(tài)反應之間的比對試驗。具體實驗為頸部左側注射國產國產牛型PPD,另一側用國外比較變態(tài)反應,即上三分之一注射國外牛型PPD,下三分之一注射國外禽型PPD。

1.8.1 國產與國外牛PPD的比對 比對左側國產牛型PPD和右側上三分之一國外牛型PPD的試驗結果,以評價國產牛型PPD的應用效果。

1.8.2 國內與國外常規(guī)檢疫方法的比對 比對左側國內常規(guī)變態(tài)反應試驗和右側國外比較變態(tài)反應的實驗結果,以評價我國常規(guī)方法的應用效果。

1.8.3 國內比較變態(tài)反應與國外比較變態(tài)反應之間的比對 綜合左側國產牛型PPD和右側下三分之一國外禽型PPD的實驗結果為國內比較變態(tài)反應,與右側的國外比較變態(tài)反應進行比對,評價國內比較變態(tài)反應的應用效果。

1.9 牛分枝桿菌的分離 撲殺比較變態(tài)反應和干擾素試驗均為陽性的2頭牛,取病變組織進行細菌分離,以部分驗證比較變態(tài)反應和干擾素試驗準確性。

2 結 果

2.1 γ-干擾素檢測方法與國外比較變態(tài)反應的比較試驗 167頭牛同時應用γ-干擾素試驗和國外比較變態(tài)反應進行檢測,結果均檢出陽性牛96頭,陰性牛71頭,2者的陽性檢出率均為57.49%(96/167)。2者之間的陽性符合數為89頭,陽性符合率為92.7%(89/96)。如果以比較變態(tài)反應作為金標準,96頭比較變態(tài)反應陽性牛中,γ-干擾素試驗檢出的陽性牛為 89頭,γ-干擾素試驗的敏感性為92.71%(89/96);71頭比較變態(tài)反應陰性牛中,γ-干擾素試驗檢出的陰性牛為64頭,特異性為90.14%(64/71,見表1)。證實與比較變態(tài)反應相比,干擾素試驗具有較好的敏感性和特異性。

2.2 γ-干擾素檢測方法與牛型PPD單純頸部變態(tài)反應的比較試驗 167頭牛同時進行γ-干擾素檢測試驗和牛型PPD單純頸部皮試。結果γ-干擾素檢測試驗檢出陽性牛96頭,陽性檢出率為57.49%(96/167);國內常規(guī)單純牛型PPD頸部皮試檢出陽性牛121頭,陽性檢出率為72.45%(121/167);國內常規(guī)牛型PPD單純頸部皮試的陽性檢出率明顯高于γ-干擾素檢測試驗。證實國內常規(guī)牛型PPPD單純皮試與干擾素試驗相比特異性較差。這主要是由于部分牛型PPD陽性牛,在γ-干擾素試驗中禽型PPD刺激上清的檢測中也為陽性,從而使這些樣品在γ-干擾素試驗中最終檢測為陰性結果。而一般認為,禽型PPD陽性是由禽分支桿菌等引發(fā)的非特異性反應,因此證實γ-干擾素試驗可以排除一部分非特異性反應,見表2。

表1 γ-干擾素試驗和比較變態(tài)反應的比較試驗結果(單位:頭)Table 1 Comparative result of IFN-γ and comparative skin test

表2 γ-干擾素試驗與牛型PPD皮試的比較試驗(單位:頭)Table 2 Comparative result of IFN-γand single skin test

2.3.1 國產與國外牛PPD的比對 106頭牛中,國產牛型PPD檢出陽性數為84頭,陽性率79.25%(84/106);國外牛型PPD檢出陽性牛83頭,陽性率為78.3%(83/106),兩者具有相近的陽性檢出率。2者之間的陽性符合數為 78頭,陽性符合率為93.41%(78/83.5),見表3。證實2者具有較好的陽性符合率。

2.3.2 國內與國外常規(guī)檢疫方法的比對 106頭牛中,國內常規(guī)變態(tài)反應檢出陽性牛84頭,陽性率為79.25%(84/106);國外常規(guī)的比較變態(tài)反應方法檢出陽性牛66頭,陽性率為62.26%(66/106)。國內常規(guī)試驗的陽性檢出率明顯高于國外常規(guī)實驗陽性檢出率。如果以國外比較變態(tài)反應方法為金標準,66頭國外皮試陽性牛中,國內皮試陽性牛為63頭,敏感性為95.45%(63/66);40頭國外皮試陰性牛中,國內皮試陰性牛19頭,特異性為47.5%(19/40),見表4。證實國內皮試的特異性很低。

表3 國產PPD與國外PPD的比較試驗(單位:頭)Table 3 Comparative result of bovine PPD of China and bovine PPD of Holland

表4 國內常規(guī)變態(tài)反應與國外比較變態(tài)反應的比較(單位:頭)Table 4 Comparative result of single cervical test of China and comparative skin test of Holland

2.3.3 國內比較變態(tài)反應與國外比較變態(tài)反應之間的比對 106頭牛,國內比較變態(tài)反應檢出的陽性牛為62頭,陽性率為58.49%(62/106);國外比較變態(tài)反應檢出的陽性牛為66頭,陽性率為62.26%(66/106)。2者具有相似的陽性檢出率,它們之間的陽性符合數為59頭,陽性符合率為92.19%(59/64),見表 5。

表5 國內與國外比較皮試的比較試驗結果(單位:頭)Table 5 Comparative result of comparative skin test of China and comparative skin test of Holland

2.4 牛分枝桿菌的分離 從撲殺的2頭陽性牛病變淋巴結中,分離出了2株分枝桿菌,經多重PCR鑒定為牛結核分枝桿菌,部分證實了比較變態(tài)反應和干擾素試驗的準確性。

3 討 論

3.1 關于牛結核活畜檢疫中的方法選擇問題 牛結核病的診斷方法主要有病原學診斷和免疫學診斷。病原學診斷包括傳統(tǒng)的細菌學檢測和分子生物學診斷技術。細菌學檢測在發(fā)達國家常作為診斷牛結核的確診試驗〔3〕,但由于分支桿菌生長緩慢,該方法需要耗費較長時間才能做出診斷。很多科學家建立了PCR用于診斷牛結核〔9-10〕,但試驗結果均認為其敏感性較差,這可能與體內分支桿菌的繁殖特征有關。而且這些方法大多需要采集死亡家畜的病料來檢測,因此病原學診斷并不適合大規(guī)模的活畜檢疫。牛結核的免疫學診斷方法包括細胞免疫學診斷方法和抗體檢測方法,由于牛結核的免疫以細胞免疫為主,注定了抗體檢測方法較低敏感性,因此目前臨床上使用最為廣泛的只能是是細胞免疫學診斷方法。

3.2 關于國內常規(guī)牛型PPD變態(tài)反應 我國大多數牛場只是利用單純的牛型PPD進行頸部皮膚試驗,檢出陽性牛即進行撲殺或隔離,但該方法在我國的應用并不理想。我們將國際上較為先進的γ-干擾素試驗和常用的比較變態(tài)反應試驗引入我國,并與我國常用的牛型PPD皮試進行了比較。結果單純的牛型PPD皮試,與國外通用的比較變態(tài)反應和γ-干擾素試驗相比,其特異性很差。這是由于比較皮試和γ-干擾素試驗剔除掉的一部分禽型PPD陽性牛,在單純的牛型PPD皮試中多為陽性。

3.3 關于干擾素試驗 牛γ干擾素試驗被認為是除變態(tài)反應以外的最具有應用前途的一種新型試驗方法,已經成為很多發(fā)達國家的法定牛結核檢疫方法〔6-8〕。我們的試驗認為,與比較變態(tài)反應試驗,γ-干擾素試驗具有較好的敏感性和特異性,且與比較皮試具有很好的符合率。該方法可以在實驗室內進行,判定結果更為客觀,而且與皮試相比,試驗所需時間較短。同時,該方法還可以同布病檢疫結合起來,一次抽血可以同時檢測2種疾病。因此,γ-干擾素試驗在牛結核檢疫中具有廣闊的應用前景。但該方法也存在著很多缺陷,主要是成本偏高,而且需要較高水平的實驗室才能進行操作。

3.4 關于比較變態(tài)反應 發(fā)達國家均以比較變態(tài)反應作為撲殺結核陽性牛的依據〔4-6〕。我們的試驗也證實,國內比較變態(tài)反應可以剔除一部分禽型PPD陽性牛,而通常認為禽型PPD陽性是由禽分支桿菌等引發(fā)的非特異反應。與國外通用的比較變態(tài)反應相比,國內比較皮試具有較高的敏感性和特異性,而且與國外比較皮試具有較好的符合率(92.19%)。因此國內比較變態(tài)反應在不降低敏感性的同時,完全可以提高我國牛結核檢疫的特異性。

3.5 關于禽型PPD的陽性率 5個牛群禽型PPD陽性率由3.2%到34.7%不等,似乎是牛PPD陽性率越高,禽型PPD陽性率越低,但這需要更多的數據來證實。但該結果影響了我們最初對干擾素試驗敏感性的判斷。因為當牛場具有較低陽性率的時候,我國常規(guī)牛型PPD檢疫方法與γ-干擾素試驗及比較變態(tài)反應的符合率均較差。同時如果以常規(guī)牛型PPD檢疫方法來判定,γ-干擾素試驗的敏感性又過于底下。但當牛場的陽性率較高時,這些方法就具有了較好的符合率。

3.6 本試驗的不足 國外通常撲殺變態(tài)反應陽性牛,取病變組織或淋巴結進行細菌培養(yǎng)來確診牛結核病,并確定試驗的陽性牛。我們由于撲殺經費不足,不能撲殺陽性牛,所以不能確定被檢牛群的陽性組,只能確認該牛群為結核陽性牛群,即結核污染牛群,而且本實驗主要是不同方法在結核污染牛群中的應用,因此也未涉及結核陰性牛群,這需要我們下一步的工作進行補充。國外常以細菌培養(yǎng)作為金標準,同樣由于經費的原因,本研究只能撲殺2頭牛,培養(yǎng)部分牛分枝桿菌,以驗證其他檢疫方法的準確性。

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Application of interferon-γtesting and the comparative cervical skin test in herds infected withMycobacterium bovis

ZHANG Xi-yue,HU Xi-dan,YANG Jing-wei,CHAO rui,HUANG Bao-xu,FAN Wei-xing
(China Animal Health&Epidemiology Center,Qingdao266032,China)

The interferon-γtesting and the comparative cervical skin test were compared with the simple cervical hypersensitivity test routinely used in our country in herds infected withMycobacterium bovis,in which 167 infected cattle from 5 herds were tested with interferon-γtesting and the comparative cervical test(CCT)simultaneously and other 106 cattle were tested with other hypersensitivity tests used as control for comparison.In these 167 cattle tested with both tests,89 cattle were proved to be positive both in interferon-γtesting and CCT using the bovine PPD of Netherland with a coincidence rate of 92.7%(89/96).In 106 cattle the coincidence rate of positive reactions detected by γ-interferon test and CCT was 93.41%(78/83.5),that detected by the routine skin of foreign country was 62.26%(66/106);and that between the hypersensitivity test of China and foreign country was 92.19%(59/64).It is obvious that the interferon-γtesting and CCT seem to have higher coincidence rate and the specificity of the skin tests used in our country was rather low.Consequently,the use of the comparative cervical skin test should be considered to replace the routinely used shin tests.

bovine tuberculosis;IFN-γ;comparative cervical test

S855.2

A

1002-2694(2010)01-0053-04

*國家科學技術部863項目(2007AA022405)

范偉興,Email:fwx sjl@126.com

1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,青島 266032;

2.新疆牧科院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

2009-05-18;

2009-09-19