林志強(qiáng), 李希東, 侯麗霞, 張英昊, 劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青島 266109)

葡萄感染霜霉病菌后幾種信號(hào)物質(zhì)的變化

林志強(qiáng), 李希東, 侯麗霞, 張英昊, 劉 新*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青島 266109)

以3個(gè)抗病性不同的釀酒葡萄品種(‘西拉’＞‘霞多麗’＞‘赤霞珠’)葉片為材料,檢測霜霉病菌侵染后幾種病原相關(guān)信號(hào)物質(zhì),如脫落酸(ABA)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)等的變化,以探討葡萄抵御霜霉病菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。結(jié)果表明,H2O2和NO是葡萄感應(yīng)霜霉病菌的早期信號(hào)分子,且抗性較強(qiáng)的品種‘西拉’的變化最為明顯;JA和ABA是抗性較差品種‘赤霞珠’應(yīng)答霜霉病的信號(hào)組分。而3個(gè)抗性不同葡萄品種的乙烯變化無明顯差別。推測H2O2、NO、JA和ABA均參與了葡萄對(duì)霜霉病菌的防御反應(yīng),但不同品種間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分可能存在差異。

葡萄; 霜霉病; 信號(hào)物質(zhì); 抗病性

由葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(Berk.etCurtis)Ber.etde Toni]引起的葡萄霜霉病(grape downy mildew)是葡萄生產(chǎn)中最嚴(yán)重的真菌病害之一[1-2]。在釀酒葡萄的栽培和生長過程中極易發(fā)生,嚴(yán)重影響著植株的生長和果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì),進(jìn)而也大大制約了葡萄酒的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。因此,選育抗霜霉病的葡萄品種,研究其致病機(jī)理和抗病機(jī)制成為農(nóng)業(yè)科學(xué)工作者的一項(xiàng)重要任務(wù)。

不同葡萄品種對(duì)霜霉病菌的抗性存在著明顯的差異,沙月霞等發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種對(duì)霜霉病菌的抗性表現(xiàn)出明顯差異,‘白比諾’(‘Pinot Blanc’)抗性最強(qiáng),‘品麗珠’(‘Cabernet France’)抗性最弱[4]。研究表明,植物感病后會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)、胼胝質(zhì)的加厚、保護(hù)酶含量的升高、病程相關(guān)蛋白的表達(dá)等早期的防衛(wèi)反應(yīng)以抵御霜霉病菌的侵染,一氧化氮(NO)、過氧化氫(H2O2)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯(ethylene,ETH)等信號(hào)物質(zhì)參與此過程[5-8]。NO和H2O2可協(xié)同作用提高苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和幾丁質(zhì)酶(chitinase)等保護(hù)酶的活性,參與番茄對(duì)黑色根霉菌的防御反應(yīng)[9]。據(jù)報(bào)道,病原菌侵染會(huì)引起植物體內(nèi)源激素含量變化,進(jìn)而激活植物防御反應(yīng)基因的表達(dá)[10]。外施茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me-JA)能夠有效地控制采后綠熟期番茄果實(shí)根霉果腐病癥狀的發(fā)展,同時(shí)提高了番茄果實(shí)中苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶的活性[11];利用外源 ABA生物合成抑制劑氟啶草酮(fluridone)和氟草敏(norflurazon)以及ABA缺失突變體等研究發(fā)現(xiàn),增加ABA含量能提高植物對(duì)病菌的敏感性[12];葡萄在感染病原菌早期會(huì)產(chǎn)生大量乙烯,外施乙烯利(ethephon)增加與致病相關(guān)的CH IT4c,PIN,PGIP和GLU等蛋白基因表達(dá)和提高了葡萄對(duì)白粉病的抗性[13]。但目前有關(guān)葡萄受到霜霉病菌侵染后ABA、H2O2、NO和JA等內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)變化的研究鮮有報(bào)道。

NO、H2O2、ABA、JA 和乙烯參與多種植物的不同防御反應(yīng),那么它們是否與葡萄抵抗霜霉病有關(guān)?在霜霉病菌侵染葡萄葉片的過程中其變化怎樣?本研究通過檢測抗性不同葡萄品種葉片在受到霜霉病菌侵染后NO、H2O2和ABA等內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)的變化,力圖尋找與抗病相關(guān)的信號(hào)物質(zhì),為進(jìn)一步探明霜霉病的抗病機(jī)制、選育抗性釀酒葡萄栽培品種和病害防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

葡萄霜霉病菌采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葡萄實(shí)驗(yàn)基地‘霞多麗’發(fā)病葉片。

1.2 供試品種

3個(gè)主栽釀酒葡萄品種:‘赤霞珠’(‘Cabernet Sauvignon’)、‘西拉’(‘Syrah’)和‘霞多麗’(‘Chardonnay’)。

1.3 病情調(diào)查及病情指數(shù)計(jì)算

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]:0級(jí),全葉無病斑;1級(jí),病斑占葉片總面積≤5%;2級(jí),5%＜病斑占葉片總面積≤25%;3級(jí),25%＜病斑占葉片總面積≤50%;4級(jí),50%＜病斑占葉片總面積≤75%;5級(jí),病斑占葉片總面積75%以上,或葉片枯死。

病情指數(shù)=[∑(受害級(jí)別×該級(jí)葉片數(shù))/總?cè)~數(shù)×最重發(fā)病級(jí)別代表數(shù)]×100。

1.4 田間霜霉病病情調(diào)查

分別于2008年8月下旬至9月底,對(duì)煙臺(tái)蓬萊中糧君頂酒莊3個(gè)葡萄品種進(jìn)行了霜霉病的田間調(diào)查,統(tǒng)計(jì)病葉率和按照上述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)。每株任意選取一個(gè)新梢,調(diào)查整個(gè)新梢葉片的感病性,每個(gè)小區(qū)每個(gè)品種調(diào)查100個(gè)葉片左右,調(diào)查7個(gè)小區(qū)。

1.5 孢子囊接種濃度的選擇

1.5.1 病原菌的采集與繁殖

從田間‘霞多麗’葡萄品種上采回霜霉病葉片,清水沖去舊孢子囊,于20℃和相對(duì)濕度100%下培養(yǎng)24 h,待新孢子囊長出后,用毛刷刷下孢子囊,無菌水配制成 2×104、4×104、8×104個(gè)/mL和 16×104個(gè)/mL孢子囊懸浮液。接種前用載玻片萌芽法測定孢子囊生活力,萌芽率85%以上為有效。

1.5.2 霜霉病菌的接種

采取健康無病的盆栽葡萄植株一年生枝條3～6葉位葉片,用0.1%升汞消毒2 min,無菌水沖洗數(shù)次后,用打孔器制成直徑1 cm的葉碟,每個(gè)品種100片左右,平均分成3份,每個(gè)品種各取1份作為一個(gè)處理,3次重復(fù),葉背向上平放在濕度為100%的培養(yǎng)基上,用微量移液器進(jìn)行接種,每個(gè)葉片接種30 μ L。將培養(yǎng)皿置20℃培養(yǎng)箱中,7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況,計(jì)算病情指數(shù)。

1.6 室內(nèi)離體葉片接種鑒定

每個(gè)品種取3～6葉位葉片100片左右,以8×104孢子囊/mL的菌液對(duì)3個(gè)品種的離體葉片進(jìn)行噴霧接種,置于濕度100%、溫度20℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3次重復(fù),7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)。

1.7 葡萄葉片內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)含量測定

1.7.1 處理

以孢子囊濃度8×104個(gè)/mL的菌液對(duì)3個(gè)不同葡萄品種盆栽的3～6葉位健康葉片背面進(jìn)行噴霧接種,套袋保濕24 h,按上述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采集3個(gè)葡萄品種感染霜霉菌的各級(jí)葉片。每個(gè)病級(jí)采集20個(gè)葉片,液氮迅速冷凍后,將葉片敲碎混勻用于試驗(yàn)。

1.7.2 NO含量的測定

用NO試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)。取0.1 g處理過的葉片加0.9 mL 0.9%NaCl,勻漿;離心,取上清,沸水浴 5 min;12 000 g離心5 min,取上清,稀釋 10倍,在 550 nm 波長下,測定吸光度值,計(jì)算出組織中的NO水平。對(duì)照和處理都是3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.7.3 H2O2含量的測定

參照郝再彬等[14]的方法,取葉片,加預(yù)冷丙酮研磨成漿;離心,取上清,依次加入硫酸鈦和濃氨水;5 000 r/min離心10 min后棄上清,洗滌5次,用硫酸溶解沉淀,在415 nm波長下,測定吸光度值。對(duì)照和處理都是3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.7.4 ABA和JA含量的測定

取0.3 g接種處理過的葉片,加1.5 mL 80%甲醇,勻漿;ELISA法測定ABA和JA含量[15],試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控研究室。

1.7.5 乙烯釋放量的測定

每個(gè)病級(jí)都選取葉位和質(zhì)量相同的2個(gè)葡萄葉片,放于100 mL三角瓶中,用3層封口膜將瓶口封好,在20℃下,放置4 h。由瓶內(nèi)取氣1 mL注入GC-2010氣相色譜儀測定乙烯含量。氣相色譜儀載氣為高純氮?dú)?流速38.7 mL/min,載氣溫度為150℃;氫火焰離子檢測器 FID,檢測室溫度為200℃,氣譜柱為GDX-502填充柱,內(nèi)徑0.53 mm,薄膜厚度1.00 μ m,柱長10 m,柱溫80 ℃。乙烯釋放量速率以每克鮮重每小時(shí)生成的nmol數(shù)表示,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

測定結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)葡萄品種感染霜霉病菌的田間調(diào)查

由表1可以看出,3個(gè)供試葡萄品種在田間自然狀態(tài)下均感霜霉病,病情指數(shù)范圍為 19.50～36.71。但對(duì)霜霉病的抗性表現(xiàn)出明顯的差異,‘西拉’發(fā)病率最低為45.28%,病情指數(shù)最小為19.50,對(duì)霜霉病抗性最強(qiáng);‘赤霞珠’抗性最弱,發(fā)病率最高,病情指數(shù)最大。

表1 田間3個(gè)葡萄品種霜霉病自然發(fā)病情況1)

2.2 霜霉病菌孢子囊接種濃度的選擇

用不同濃度的霜霉病菌孢子囊菌液侵染葡萄離體葉圓片,8×104孢子囊/mL和16×104孢子囊/mL接種霜霉病菌所引起的病情指數(shù)最高,達(dá)到了極顯著水平,能在短時(shí)間內(nèi)區(qū)分不同品種對(duì)霜霉病的抗性差異(表2)。但16×104孢子囊/mL濃度接種霜霉菌部分葡萄葉片第3天病情指數(shù)達(dá)到5級(jí),侵染過快不利于信號(hào)物質(zhì)的分析和測定。據(jù)此認(rèn)為8×104孢子囊/mL最佳,并在以下的試驗(yàn)中以此濃度作為合適的處理濃度。

表2 葡萄離體葉圓片對(duì)霜霉菌孢子囊接種濃度的敏感性1)

2.3 3個(gè)葡萄品種離體葉片接種抗性表現(xiàn)

室內(nèi)離體葉片接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種均感霜霉病(表3),但品種間對(duì)霜霉病的抗性表現(xiàn)出了顯著的差異,病情指數(shù)范圍為24.36～61.29。其中,‘西拉’對(duì)霜霉病抗性最好,病情指數(shù)最低;‘赤霞珠’最感病,病情指數(shù)最高。表明3個(gè)葡萄品種室內(nèi)離體葉片接種霜霉菌的抗性表現(xiàn)與霜霉病的自然發(fā)病情況基本一致,本方法較為可靠。

表3 3個(gè)葡萄品種離體葉片對(duì)霜霉病菌的抗性表現(xiàn)1)

2.4 不同感病期葡萄葉片內(nèi)源NO和H2O2含量變化

由圖1得知,3個(gè)葡萄品種葉片接種前(0級(jí))內(nèi)源NO水平基本一致,病級(jí)為1級(jí)時(shí),3個(gè)品種葉片NO含量增加,且都達(dá)到了極顯著水平;其中‘西拉’變化最大,增加48.80%。接種前‘西拉’葉片內(nèi)源H2O2含量最高,接種后葉片內(nèi)源H2O2含量變化幅度最大,病級(jí)為1級(jí)時(shí) H2O2含量增加37.73%,達(dá)到了極顯著水平;‘赤霞珠’和‘霞多麗’含量增加較大,達(dá)到了顯著水平。

圖1 3個(gè)葡萄品種不同病級(jí)葉片內(nèi)源NO和H2O2含量變化

2.5 不同感病期葡萄葉片內(nèi)源JA和ABA含量變化

接種霜霉病菌前‘赤霞珠’JA和ABA含量較高,‘西拉’含量較低;接種后,3個(gè)葡萄品種葉片內(nèi)源JA和ABA含量都有所增加,且存在品種間差異(圖2)?！嘞贾椤〖?jí)達(dá)到2級(jí)時(shí),JA含量達(dá)到最大值,變化最明顯,增加157.08%,達(dá)到了極顯著水平;‘霞多麗’和‘西拉’在3級(jí)時(shí)葉片內(nèi)源JA含量都達(dá)到最大值,‘霞多麗’變化(117.01%)大于‘西拉’(71.50%)。3個(gè)品種葉片內(nèi)源ABA含量均在3級(jí)時(shí)達(dá)到最大值,‘赤霞珠’變化較明顯,增加 95.27%,達(dá)到了極顯著水平;‘霞多麗’和‘西拉’變化較小,差異不顯著。

圖2 3個(gè)葡萄品種不同病級(jí)葉片JA和ABA含量變化

2.6 不同感病期葡萄葉片乙烯釋放量的變化

由圖5可以看出,‘西拉’健康葉片乙烯水平最高,‘赤霞珠’最低;在感病初期不同抗性葡萄葉片乙烯釋放量幾乎沒有變化,5級(jí)時(shí)都達(dá)到了最大值(圖3),但品種間差異不顯著。

3 討論

圖3 3個(gè)葡萄品種不同病級(jí)葉片ETH釋放量變化

目前我國主栽釀酒葡萄品種多為歐亞種葡萄(Vitis vini f era),對(duì)霜霉病抗性較弱。特別是在高濕度的沿海地區(qū),霜霉病嚴(yán)重地影響著葡萄的生長和果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對(duì)膠東葡萄主栽地區(qū)蓬萊的‘西拉’、‘霞多麗’和‘赤霞珠’3個(gè)主要釀酒葡萄品種進(jìn)行了田間自然發(fā)病率調(diào)查,結(jié)果表明‘西拉’抗病性最強(qiáng),‘赤霞珠’抗病性最弱,室內(nèi)離體葉片接種試驗(yàn)表明,接種以8×104孢子囊/mL最佳,可在短時(shí)間內(nèi)區(qū)分不同品種之間對(duì)霜霉菌的抗性差異,且感病情況與田間調(diào)查趨勢基本一致,這與沙月霞等[4]的研究結(jié)果相似。

NO和H2O2含量變化是植物對(duì)許多生物或者非生物脅迫的一種普遍的早期反應(yīng),在植物的正常生長發(fā)育和對(duì)環(huán)境應(yīng)答等過程中起著十分重要的作用。最近,Manjunatha等以珍珠粟(pearl millet)為材料,證明NO通過參與和調(diào)控過敏反應(yīng)、胼胝質(zhì)形成和病程相關(guān)蛋白表達(dá)等早期防衛(wèi)反應(yīng)來增強(qiáng)對(duì)霜霉病菌的抗性[16]。Ma? olepsza和 Rózalska研究發(fā)現(xiàn)番茄葉片感染灰葡萄孢(Botrytis cinerea)后,NO和ROS含量迅速升高,NO和H2O2達(dá)到有效的平衡才能增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病的抗性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉片接種霜霉病菌后NO和H2O2含量都有所升高,病級(jí)為1級(jí)時(shí),3個(gè)葡萄品種葉片內(nèi)源NO和H2O2含量都達(dá)到峰值,且這種變化在抗性品種西拉中更為強(qiáng)烈,說明NO和H2O2在葡萄抗霜霉菌的抗性反應(yīng)中起重要作用,可能均是葡萄應(yīng)答霜霉病菌侵染過程的信號(hào)物質(zhì)。但在葡萄霜霉病達(dá)到5級(jí)時(shí),H2O2含量再次增加。推測霜霉病造成葉片干枯或死亡時(shí),大量積累的H2O2對(duì)葡萄造成氧化脅迫。

ABA[18]、JAs[19]和乙烯[13]均可作為一種脅迫信號(hào)物質(zhì),誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)以抵御病原菌和環(huán)境脅迫。研究發(fā)現(xiàn),黃瓜經(jīng)褐斑菌誘導(dǎo)后葉片中JA大量積累,最高可達(dá)5 000ng/g鮮重[20]。葡萄不同節(jié)位葉片中ABA含量不同,26～30節(jié)位處最高,達(dá)到420 ng/g鮮重[21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)葡萄葉片內(nèi)源JA含量高于ABA,接種霜霉病菌后‘赤霞珠’葉片中JA和ABA水平明顯升高,JA變化較早且更為顯著。推測,JA和ABA可能是參與‘赤霞珠’與霜霉病菌互作過程中的重要信號(hào)物質(zhì)。葡萄葉片感病過程中乙烯幾乎沒有變化,病級(jí)達(dá)到5級(jí)時(shí)才發(fā)生變化,且品種間沒有顯著差異。推測乙烯不是參與葡萄對(duì)霜霉病應(yīng)答的信號(hào)分子,乙烯量升高是葉片的衰老和枯死所致。

在植物響應(yīng)外界各種刺激的過程中,多種信號(hào)物質(zhì)之間的互作和應(yīng)答(cross-talk),構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),共同激活下游的一系列抗性相關(guān)反應(yīng)。徐茂軍等的研究表明,JA是作用于NO下游的信號(hào)物質(zhì)[22]。NO和H2O2協(xié)同或單獨(dú)作用誘導(dǎo)棉花細(xì)胞對(duì)大麗輪枝菌毒素的抗性反應(yīng)[23]。近期研究發(fā)現(xiàn),蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphroditaRchb.F.)衰老過程中葉片和萼片NO和H2O2含量迅速增加,利用NO供體和NO清除劑證明NO位于H2O2上游[24]。那么在葡萄和霜霉病互作過程中NO、H2O2、ABA和JA等信號(hào)物質(zhì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中的相互關(guān)系怎樣?這些信號(hào)分子在調(diào)控霜霉菌抗性反應(yīng)中的具體作用機(jī)制如何尚有待進(jìn)一步深入研究。

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Variation of signal substances in grape cultivars in response to Plasmopara viticola

Lin Zhiqiang, Li Xidong, Hou Lixia, Zhang Yinghao, Liu Xin
(College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

Several disease-resistant signal substances,such as abscisic acid(ABA),hydrogen peroxide(H2O2),nitric oxide(NO),jasmonic acid(JA)and ethylene(ETH),in the leaves of 3 grape cultivars,‘Syrah’,‘Chardonnay’and ‘Cabernet Sauvignon’,with different resistance toPlasmopara viticola,were studied in order to detect the signal transduction mechanisms.The results showed that H2O2and NO were involved in the disease response,and‘Syrah’showed strong resistance;JA and ABA were involved in the disease response of the susceptible variety‘Cabernet Sauvignon’.Moreover,the level of ETH had no significant difference among the 3 cultivars used.It was presumed that H2O2,NO,JA and ABA were involved in resistance against the downy mildew disease,but there were significantly different reactions among the three cultivars employed.

grape; downy mildew; signal substances; resistance

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2010.02.010

2009-04-08

2009-05-26

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2006-G26)

*通信作者Tel:0532-88030224;E-mail:liuxin6080@yahoo.com.cn