金光澤, 段作營, 張蓮芬, 金堅, 李華鐘＊

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室;2.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇無錫 214122)

重組融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突變體在畢赤酵母中的表達

金光澤1, 段作營1, 張蓮芬2, 金堅2, 李華鐘＊1

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室;2.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇無錫 214122)

構建編碼人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重組表達質粒,在Pichia pastorisGS115中表達,獲得具有較高IL-2活性的融合蛋白。設計并合成符合P.pastoris密碼子偏好,且含有C125A突變的IL-2編碼基因IL-2m,通過酶切連接方法將其與人血清白蛋白(HSA)的編碼基因連接為融合蛋白HSA-IL2m的編碼基因?？寺〉奖磉_質粒pPIC9K中,電擊轉化P.pastorisGS115感受態(tài)細胞,獲得重組P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。搖瓶發(fā)酵獲得分泌表達產物。結果:Western blot鑒定結果顯示該融合蛋白與IL-2、HSA的抗體都能發(fā)生免疫反應。經脫鹽、凍干制備的粗蛋白的IL-2生物學活性為1.51×106IU/mg。結論:在P.pastorisGS115中成功表達了具有人白介素-2生物學活性的HSA-IL2m融合蛋白。

突變型人白介素-2;人血清白蛋白;畢赤酵母;融合蛋白

白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2),又稱T細胞生長因子,1976年由Morgan等首先在外周血淋巴細胞中發(fā)現[1],是輔助T細胞分泌的淋巴因子,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。它是中國第一個基因工程生產的蛋白質藥物[2],臨床上可用于惡性腫瘤治療、感染性疾病的治療、鎮(zhèn)痛等[3]。由于IL-2在人體內的半衰期很短,臨床多采用高劑量頻繁給藥,這不僅增加患者的經濟負擔更有可能產生不良副作用[4]。為了克服上述缺點,作者利用人血清白蛋白融合技術(albumin fusion technology)構建了編碼人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)和IL-2的融合基因,通過分泌型表達載體pPIC9K,將該融合基因整合到巴斯德畢赤酵母染色體中,在分泌信號肽的作用下分泌表達融合蛋白HSA-IL2,以增加其半衰期。同時,為了能夠大量生產具有較高的IL-2活性的融合蛋白,對IL-2分子的編碼序列進行了改造。IL-2的成熟分子由133個氨基酸殘基組成,它剪切掉了IL-2 N-端20個氨基酸殘基的信號肽,翻譯后加工的過程還包括在58位和105位半胱氨酸(Cys)之間形成二硫鍵,正確的二硫鍵對于IL-2活性的保持是必需的[5],而肽鏈中第三個Cys位點的存在極有可能造成二硫鍵的錯配產生無活性異構體和多聚體。根據畢赤酵母密碼子使用頻率,替換天然IL-2編碼序列中的低頻密碼子,并設計合成了第125位游離Cys點突變?yōu)锳la的突變型人白介素-2(mutant Interleukin-2, IL2m)的編碼基因。再通過表達條件優(yōu)化,得到較高的融合蛋白產量及生物學活性。

1 材 料

1.1 質粒、菌株和細胞株

大腸桿菌Escherichia coliXL1-Blue和含有HSA編碼基因的質粒pBlue/HSA為作者所在實驗室保存,畢赤酵母Pichia pastorisGS115和酵母分泌型表達質粒pPIC9K購自Invitrogen公司, IL2m的編碼基因委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 酶和其他試劑

Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit(OMEGA BIO-TEK),限制性內切酶、T4 DNA Ligase、 Taq DNA Polymerase、PCR試劑:Takara寶生物公司產品;Interleukin-2 Antibody(sc-34799):Santa公司產品;Donkey anti-Goat/HRP(KC-GT-035):上海康成生物有限公司產品;HSA兔抗人多克隆抗體:作者所在實驗室制備;Goat anti-Rabbit IgG/ HRP(bse-0295G):北京博奧森公司產品;脲微量白蛋白測定試劑盒:上海名典生物公司產品;其余試劑均為分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,p H 7.2;固體LB培養(yǎng)基添加質量分數1.5%的瓊脂;

酵母培養(yǎng)基YPD、MD、BMGY、BMMY、YPD按照文獻[6]方法配制。

2 方法

2.1 融合蛋白基因的克隆

2.1.1 IL2m基因的設計與合成 參照GenBank中天然IL-2編碼基因序列,根據http://www.kazusa.or.jp/codon/數據庫提供的Pichia pastoris密碼子信息,保留天然IL-2編碼基因中的高頻及次高頻密碼子,用高頻密碼子替換剩余的所有低頻密碼子,并突變天然IL-2第125位Cys為Ala。設計如下序列:

其中S1為設計合成序列,S2是天然IL-2的編碼序列。S1的5’端序列GCCTTA GGCTTA為人血清白蛋白的編碼基因3’末端的序列,下劃線部分為限制性內切酶位點,TAA是終止密碼,兩者之間的396個堿基為IL2m的編碼序列。全部序列長423 bp,交由上海生工生物工程公司合成并克隆到載體pUC57中。

2.1.2 HSA-IL2m融合蛋白的表達基因的構建質粒pBlue/HSA經Eco81I、NotI雙酶切,回收含有HSA序列的載體片段。質粒pUC57-IL2m經Eco81I、N otI雙酶切,回收IL2m片斷,連接兩片段后,轉化E.coliXL1-Blue,根據Amp抗性挑選轉化子。提取質粒,酶切驗證,得到含有人血清白蛋白-人白介素2C125A(HSA-IL2m)的序列的重組質粒pBHIm。

2.1.3 表達載體的構建 質粒pPIC9k和pBHIm經EcoRI、N otI雙酶切,回收兩片斷,連接后,轉化E.coliXL1-Blue,根據Amp抗性挑選轉化子

pPHIm。提取質粒,酶切驗證,并送上海生工生物技術有限公司測序。

2.2 融合蛋白表達與鑒定

2.2.1 酵母細胞轉化 質粒pPHIm經S alI酶切,回收線性化片斷,電擊轉化P.pastorisGS115。感受態(tài)細胞的制備方法及酵母轉化方法同參考文獻[7]。

2.2.2 重組克隆篩選及產物表達 將電擊轉化的酵母細胞以合適的稀釋度涂布含有1 mol/L山梨醇的MD平板,30℃培養(yǎng)至菌落出現。初篩:挑取長出的轉化子200個,接種到含5 mL BMGY培養(yǎng)基的試管中,30℃,200 r/min培養(yǎng)36 h。置于4℃冰箱中待菌體自然沉降,無菌條件下棄上清,加入1 mL BMMY培養(yǎng)基,30℃,200 r/min誘導培養(yǎng)72 h,其間每隔24 h補加體積分數1%甲醇。5 000 r/ min,5 min離心收集上清,用脲微量白蛋白測定試劑盒測定上清液中目標蛋白的量,選取高表達量菌株,于YPD斜面4℃保藏。復篩:挑取上述初篩的菌至5 mL BMGY培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,30℃,200 r/min培養(yǎng)24 h,以體積分數1%接種量轉接到裝有100 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,200 r/min培養(yǎng)30 h左右,離心收集菌體于裝有25 mL BMMY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng),30℃,200 r/min誘導72 h,其間每隔24 h補加體積分數1%甲醇。5 000 r/min,5 min離心收集發(fā)酵上清液。結合脲微量白蛋白測定試劑盒和SDS-PAGE電泳,挑選表達量最高菌株,于YPD斜面4℃保藏。

2.2.3 重組子誘導表達產物的分析與Western blot驗證 取保存的發(fā)酵上清液,經SDS-PA GE后,電轉移蛋白至硝酸纖維素膜上,用含50 g/L脫脂奶粉的1×TBS緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,15 mmol/L NaCl,p H7.5)4℃封閉過夜,用TBS清洗后分別用兔抗人HSA或山羊抗人IL-2的抗體(1: 100)室溫孵育2 h,用TBS清洗后分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1:500)或驢抗山羊二抗(1:500)室溫孵育1 h,用TBS清洗后用DAB試劑顯色。

2.2.4 活性測定 根據中國藥2005年第三部中關于IL-2的生物活性的檢測方法,即CTLL-2/ MTT法[8],對融合蛋白的生物學活性進行檢測。文中沒有說明的其他分子生物學的實驗方法,均參照文獻[9]進行。

2.2.5 融合蛋白的搖瓶發(fā)酵誘導條件初步優(yōu)化菌體培養(yǎng)及誘導的方法同2.2.2中復篩時所用的兩步法。采用單因素實驗,根據優(yōu)化需要進行相關調整,研究初始p H、甲醇加量、轉速、誘導相與生長相培養(yǎng)基體積比等4個主要條件對HSA-IL2m表達量的影響。

3 結果與討論

3.1 融合蛋白基因的構建

質粒pBlue/HSA經Eco81I、N otI雙酶切,回收約4.7 kb的片斷;質粒pUC57-IL2m經Eco81I、N otI雙酶切,回收0.4 kb的片斷。利用這兩個片斷雙酶切所形成的粘性末端,連接后轉化E.coliXL1-Blue感受態(tài)細胞,通過Amp抗性挑選陽性轉化子,提取質粒后進行酶切驗證,結果如圖1所示,重組質粒pBHIm經EcoRI單酶切得到5.1 kb的片斷,比質粒pBlue/HSA雙酶切的回收產物多出了約0.4 kb;經EcoRI和N otI雙酶切得到長度約2.2 kb的片斷和2.9 kb的載體片斷,而HSA的編碼序列為1.8 kb,證明成功構建了HSA-IL2m的編碼基因。

3.2 表達載體pPHIm的構建

重組質粒pPHIm物理圖譜如圖2(a)所示。融合基因插入表達載體pPIC9K的EcoRI和NotI位點之間,在序列上位于AOX1啟動子和α交配因子的下游且與α交配因子的開放閱讀框相同。構建的重組質粒pPHIm的酶切鑒定見圖2(b),重組質粒pPIHm經EcoRI單酶切得到一條長約11.4 kb的產物,經EcoRI和NotI雙酶切得到長約2.2 kb的插入片斷和長約9.3 kb的載體片斷,表明融合基因已經成功插入到載體pPIC9k中。質粒測序結果顯示,全部序列沒有發(fā)生突變,與預期一致。

圖1 重組質粒pBHIm的酶切分析Fig.1 Restriction analysis of the recombinant plasmid pBHIm

3.3 陽性轉化子的篩選及誘導產物的Western blot鑒定

質粒pPHIm經S alI酶切,回收線性化片斷,電擊轉化P.pastorisGS115感受態(tài)細胞。涂布MD平板,30℃培養(yǎng)4 d后共長出了約400個轉化子,挑選其中200個菌落進行初篩,選其中表達量較高的10株重組菌進行復篩驗證,得到一株產量最高的重組菌P.pastorisGS115/pPHIm,誘導3 d后上清液的SDS-PAGE分析和Western blot結果如圖3所示。

圖2 重組質粒pPHIm的物理圖譜(A)和酶切分析(B)Fig.2 Physical map(A)and restriction analysis(B)of the recombinant plasmid pPHIm

研究發(fā)現,表達的蛋白質的相對分子質量約為82 000,與理論計算HSA-IL2m的相對分子質量相符,且這一位置的蛋白與IL-2、HSA的抗體都能發(fā)生免疫反應,進一步證實酵母經誘導表達HSAIL2m。但70 000和45 000這兩處的降解條帶又都可以與HSA的抗體發(fā)生免疫反應,認為是融合蛋白降解所產生的條帶。經白蛋白測定試劑盒測得其中白蛋白融合蛋白的量約為60.2 mg/L(以HSA-IL2m計)。

3.4 誘導產物的活性測定

發(fā)酵液經脫鹽處理后,凍干保存。取0.1 mg凍干粉用2 mL PBS復溶后,離心取上清,測得其中融合蛋白的量約為300μg/mL。采用IL-2依賴細胞株CTLL-2以標準品IL-2為對照,對上清液中的融合蛋白的生物學活性進行了測定。標準品的活性為2×105IU/mL,用RPMI1640稀釋到濃度為200 IU/mL。測定結果表明,上清液中的融合蛋白可以有效的刺激CTLL-2細胞增殖。以標準品的最高濃度OD570值為100%,計算標準品、樣品梯度百分率。將百分率換算為概率單位,以概率單位為縱坐標,以稀釋度X的對數為橫坐標,繪制直線回歸圖(圖4),通過計算得出融合蛋白粗蛋白的比活性為1.51×106IU/mg。

圖3 融合蛋白HSA-IL2m的SDS-PAGE分析(A)和Western Blot分析(B)Fig.3 SDS-PAGE(A)and Western Blot(B)of the fusion protein HSA-IL2m

圖4 數據轉換與線性回歸的概率單位分析Fig.4 Probit unit analysis of transformation and linear regression of data

3.5 融合蛋白的搖瓶誘導條件初步優(yōu)化

3.5.1 初始p H對表達量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時,將初始p H值分別調至5.0、5.5、6.0、

6.5,種子液培養(yǎng)36 h后,經離心,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h補加體積分數1%甲醇,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測定其中融合蛋白的含量。結果如圖5(a)所示,該菌表達HSA-IL2m的最適初始p H都在6左右,由于誘導培養(yǎng)基中含有0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液,測得的發(fā)酵液p H也基本在初始p H附近,因此可基本確定該菌的最適p H在6.0附近,這與Invitrogen公司的介紹相符。

3.5.2 甲醇體積分數對表達量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時,將初始p H調至6,二級種子培養(yǎng)36 h后,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體, 200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積分數補加1%,2%,3%,4%甲醇,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測定其中融合蛋白的含量。結果如圖5(b)所示,甲醇添加量為3%時HSA-IL2m的表達量最高。

3.5.3 轉速對表達量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時,將初始p H調至6,二級種子培養(yǎng)36 h后,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,分別采用旋轉式搖床150、200、250 r/min,往復式搖床100、200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積補加甲醇3%,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測定其中HSA-IL2m的含量。結果如圖5(c)所示,100(W)、200(W)為往復式搖床轉速),在裝液量體積10%條件下,隨轉速上升,表達量呈上升趨勢。相同轉速下往復式搖床的溶氧要高于旋轉式搖床,說明畢赤酵母在誘導期間對溶氧的需求量非常大,由于搖床轉速的限制,確定最適的搖床轉速為往復式200 r/ min。

3.5.4 誘導相與生長相培養(yǎng)基體積比對表達量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時,將初始p H調至6,二級種子培養(yǎng)36 h后,用1∶1、1∶0.5、1∶0.3倍體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,分別采用往復式搖床200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積補加甲醇3%,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測定其中HSA-IL2m的含量。結果如圖5(d)所示,該菌在1:0.5這個濃縮倍數下,表達量較高,在有充分的溶氧和合理的培養(yǎng)基的組分的情況下,隨著細胞密度的增加,目的蛋白的表達量會逐漸增加。由于本文研究的是在搖床條件下表達目的蛋白,當細胞密度達到一定值的時候,溶氧就成了限制菌體代謝和目的蛋白表達的重要因素,所以研究細胞密度對融合蛋白表達量的影響是有必要的。

圖5 誘導條件對HSA-IL2m產量的影響Fig.5 Effect of inducing conditions on HSA-IL2m yield

3.5.5 初步優(yōu)化的誘導條件下目的蛋白的表達配制BMMY培養(yǎng)基時,將初始p H調至6,二級種子培養(yǎng)36 h后,用1:0.5倍體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,采用往復式搖床200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h補加3%甲醇,誘導5 d,其間每隔24 h取樣保存。結果如圖8所示,從發(fā)酵液SDSPAGE電泳來看,82 000處的條帶隨時間逐漸變深,誘導3 d以后該條帶基本不再變化,因此確定搖瓶誘導持續(xù)時間為3 d。取3 d的樣品,測其中HSA-IL2m的質量濃度為144 mg/L。

圖6 優(yōu)化誘導條件下P.pastorisGS115/pPHIm表達產物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE of expressed product ofP.pastoris GS115/pPHIm under the optimized inducing condition

實驗得到的表達產物相對分子質量與HSAIL2m的理論預測值相符,Western blot發(fā)現表達產物擁有HSA和IL2m,CTLL-2/MTT法提示表達產物具有IL-2生物學活性,說明本研究的表達產物是HSA-IL2m。

根據密碼子的偏愛性,宿主細胞能夠以不同的速度合成所需要的蛋白質,需要量少的蛋白質基因由于其中有些密碼子對應的tRNA含量少,因而合成較少,反之亦然,宿主以此來控制該蛋白質的合成速度,這符合基因表達調控的規(guī)律。因此按照密碼子偏好,對外源基因編碼基因進行定向改造可以有效提高外源蛋白的表達量[10]。

HSA是含有585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化的球形蛋白質,相對分子質量65 000,它是人血漿中含量最高的蛋白質。HSA本身就是許多內源因子和外源藥物的載體,藥物蛋白和HSA結合后,可以減少其藥物利用度同時增加在體內的半衰期[11]。大多數治療用的蛋白和多肽半衰期一般較短,而HSA有將近長達19 d的血清半衰期,并且HSA的基因在畢赤酵母中可以高效分泌表達[12],搖瓶發(fā)酵表達量可達390 mg/L,上罐發(fā)酵表達量可以達到4 g/L,搖瓶發(fā)酵上清液雜質含量較少,純化方便,將藥物基因與HSA的基因融合,在畢赤酵母中表達,獲得融合蛋白,延長蛋白質藥物的半衰期。

4 結 語

將IL2m的編碼基因直接融合于HSA的編碼序列的C端,中間沒有加入任何連接肽。突變型融合蛋白在畢赤酵母中得到了分泌表達,有輕微降解。所表達的HSA-IL2m可以有效刺激CTLL-2細胞的增殖,表現較高的生物學活性。

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(責任編輯:朱明)

Expression of the Fusion Protein Human Serum Album/Mutant Human Interleukin 2C125A inPichia pastoris

J IN Guang-ze1, DUAN Zu-ying1, ZHANG Lian-fen2, J IN Jian2, LI Hua-zhong＊1
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Wuxi 214122,China;2.School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study was to obtain the fusion protein HSA-IL2m with high IL2 bioactivity,for this,the recombinant plasmid encoding HSA-IL2C125A was constructed and expressed inPichia pastorisGS115.The DNA fragment encoding mutant IL-2 of C125A was design and synthesized based on codon usage bias ofP.pastoris.The fragment was spliced with Human Serum Album encoding gene and then the fusion gene was cloned into pPIC9K to construct the expression plasmid pPHIm by restrictive digestion and ligation.Recombinant yeast ofP.pastorisGS115/pPHIm was obtained with pPHIm linearization and electroporation.The excreting product was obtained under shake flask culture.Results:Western-blot showed the fusion protein reactive positively with the antibody of IL-2 and HSA,respectively.The crude fusion protein prepared by desalting and freeze-drying showed IL-2 bioactivity of 5.0 105IU/mg. The results demonstrated that the fusion protein ofHSA-IL2m with IL-2 bioactivity wassuccessfully expressed inP.pastorisGS115.

mutant Human interleukin-2,Human serum album,Pichia pastoris,fusion protein

Q 81

:A

1673-1689(2010)04-0595-07

2009-09-03

國家自然科學基金項目(30970029);江蘇省產學研聯合創(chuàng)新資金計劃項目(BY2009110)。

＊通信作者:李華鐘(1958-),男,山東龍口人,教授,博士生導師,主要從事微生物制藥研究。Email:hzhli@jiangnan.edu.cn