戰(zhàn)雪梅 董紅巖 孫崇偉 劉麗麗 王丹 韋志永

作者單位：276000 臨沂，山東省臨沂市人民醫(yī)院病理科 （通訊作者：董紅巖，E-mail: dhy783202003@yahoo.com.cn）

肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），是影響人類生存的重大疾病之一，全世界每年死于肺癌的人數(shù)占惡性腫瘤死亡總數(shù)的17.8%[1]。SHP2是含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、侵襲、遷移等生物過(guò)程中具有重要的作用，其基因突變可導(dǎo)致多種惡性腫瘤的發(fā)生[2]，國(guó)內(nèi)外有關(guān)SHP2在肺癌組織中表達(dá)情況的報(bào)道較少。吸煙是引起肺癌的主要危險(xiǎn)因素，每年由于吸煙導(dǎo)致肺癌及其它腫瘤的死亡人數(shù)達(dá)100萬(wàn)。研究[3]表明，吸煙可導(dǎo)致多種原癌基因突變，繼而引起細(xì)胞持續(xù)性增殖和癌變，有關(guān)SHP2在吸煙肺癌患者癌組織中的表達(dá)情況目前尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組化和熒光原位雜交技術(shù)探討SHP2在吸煙肺癌患者腫瘤組織中的蛋白表達(dá)及mRNA擴(kuò)增情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集山東省臨沂市人民醫(yī)院2008年8月-2009年8月手術(shù)切除肺癌病例53例，平均年齡58.1歲（30歲-77歲），男性32例，女性21例；NSCLC 48例（鱗癌17例，腺癌19例，細(xì)支氣管肺泡癌8例，其它類型4例），SCLC 5例，選擇15例癌組織旁正常支氣管上皮作為空白對(duì)照。其中，非吸煙患者為27例，吸煙指數(shù)≥400者為21例（均為NSCLC，5例SCLC中有4例吸煙史不詳）。

1.2 石蠟包埋組織免疫組化檢測(cè) SHP2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，采用Invision法，分為實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組（加PBS代替抗體）和陽(yáng)性對(duì)照組（乳腺癌組織）。SHP2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞＜6%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；陽(yáng)性強(qiáng)度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者積分相乘，0分為陰性（-），1分-4分為弱陽(yáng)性（+），5分-8分為中度陽(yáng)性（++），9分-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[4]。

1.3 石蠟包埋組織熒光原位雜交（FISH）檢測(cè) 人SHP2原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，探針針對(duì)石蠟包埋組織內(nèi)的SHP2 mRNA，探針序列為5'-AGTATTACATGGAACATCACGGGCAATTAAAAGA G-3'、5'-ACAAGGGAATACGGAGAGAACGGTCTGGCA ATACC-3'及5'-ATGAGAGAAGACAGTGCTAGAGTCTATG AAAACGT-3'，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。探針與胞質(zhì)內(nèi)靶基因SHP2 mRNA結(jié)合，經(jīng)FITC標(biāo)記，陽(yáng)性者在熒光顯微鏡下胞質(zhì)呈亮綠色。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組（加預(yù)雜交液代替探針）和陽(yáng)性對(duì)照組（乳腺癌組織）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS軟件進(jìn)行等級(jí)計(jì)數(shù)資料的秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 SHP2在正常的支氣管上皮內(nèi)呈弱陽(yáng)性，而在多例肺癌組織中呈廣泛強(qiáng)陽(yáng)性（圖1）。

2.2 FISH檢測(cè)結(jié)果 選擇SHP2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的病例進(jìn)行FISH檢測(cè)。與對(duì)照組相比，癌細(xì)胞胞質(zhì)呈亮綠色，提示SHP2的mRNA有明顯的擴(kuò)增（圖2），也進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化的結(jié)果。

2.3 SHP2的表達(dá)與肺癌組織學(xué)類型的關(guān)系 在15例正常支氣管上皮中，SHP2大部分呈弱陽(yáng)性（80%）；在肺癌組織中，SHP2約1/3為弱陽(yáng)性（32.1%），約1/2為中度陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性（分別為47.2%和7.5%），肺癌組織中SHP2的陽(yáng)性率顯著高于正常支氣管上皮（P＜0.05）（表1）。在48例NSCLC中，SHP2的弱陽(yáng)性率為35.4%、中度陽(yáng)性率為43.8%，強(qiáng)陽(yáng)性率為6.2%；在5例SCLC中，SHP2的中度陽(yáng)性率為80.0%，強(qiáng)陽(yáng)性率為20.0%，SCLC中SHP2的陽(yáng)性率顯著高于NSCLC（P＜0.05）（表2）。

表 1 SHP2在正常支氣管上皮和肺癌組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of SHP2 in normal bronchial and lung cancer tissues

2.4 SHP2的表達(dá)與吸煙指數(shù)的關(guān)系 在吸煙指數(shù)≥400患者的NSCLC癌組織中，SHP2的弱陽(yáng)性率為23.8%，中度陽(yáng)性率為71.4%，強(qiáng)陽(yáng)性率為4.7%（總陽(yáng)性率為100%）。在非吸煙NSCLC患者癌組織中，SHP2的弱陽(yáng)性率為40.7%，中度陽(yáng)性率為37.4%，強(qiáng)陽(yáng)性率為3.7%（總陽(yáng)性率為81.5%），SHP2在吸煙指數(shù)≥400的癌組織中的陽(yáng)性率高于非吸煙患者（P＜0.05）（表3）。

圖 1 SHP2在肺癌組織中的表達(dá)（Invision法，×100）。A：SHP2在正常支氣管粘膜中呈弱陽(yáng)性；B、C和D：SHP2在肺鱗癌（B）、腺癌（C）和小細(xì)胞肺癌（D）中呈廣泛強(qiáng)陽(yáng)性。Fig 1 SHP2 expression in lung cancer tissues (Invision , ×100). A: weak positive in normal bronchial epithelium; B,C and D: strong positive in squamous cell carcinoma (B),adenocarcinoma (C) and small cell lung cancer (D).

圖 2 肺癌組織中SHP2 mRNA擴(kuò)增（熒光原位雜交法，×400）。A：空白對(duì)照組：胞質(zhì)呈淡綠色，為自發(fā)熒光；B、C和D：在鱗癌（B）、腺癌（C）及小細(xì)胞肺癌（D）中，胞質(zhì)呈較亮的綠色，為擴(kuò)增的SHP2 mRNA。Fig 2 SHP2 mRNA amplification in lung cancer tissues (FISH,×400). A: control group: dark green in the cytoplasm,which is autofluorescence; B, C and D: in squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and small cell lung cancer (D), bright green in the cytoplasm was seen, which is the amplified SHP2 mRNA.

3 討論

吸煙是肺癌最重要的危險(xiǎn)因素之一，到2030年將有800多萬(wàn)人死于吸煙。煙草中所含的多環(huán)芳烴及亞硝胺類等致癌物可導(dǎo)致Ras、p53、Rb等基因點(diǎn)突變及C-met基因構(gòu)成型激活等分子異常，進(jìn)而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[5]。Ras-Raf-MAPK通路是吸煙導(dǎo)致肺癌的重要通路，Ras基因突變啟動(dòng)Ras-Raf-MAPK通路是吸煙導(dǎo)致肺癌的重要機(jī)制[6]，KRAS基因突變?cè)诖罅课鼰熣叩陌┙M織中常見[7]。在本研究中，吸煙指數(shù)≥400的NSCLC癌組織中SHP2的陽(yáng)性率高于非吸煙者，提示吸煙可能與SHP2表達(dá)增高相關(guān)。在吸煙NSCLC患者癌組織中，RAS基因突變與SHP2分子異常的關(guān)系如何？目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，本課題組擬進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

表 2 SHP2在NSCLC和SCLC中的表達(dá)Tab 2 The expression of SHP2 in NSCLC and SCLC

表 3 在NSCLC患者中SHP2表達(dá)與吸煙指數(shù)的關(guān)系Tab 3 The relationship between SHP2 and smoking index among NSCLC patients

SHP2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員之一，它在發(fā)育、生長(zhǎng)、增殖、凋亡和分化等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用[8]。SHP2在EGF、PDGF、FGF等觸發(fā)的信號(hào)通路中起正性調(diào)節(jié)作用，在α-干擾素、γ-干擾素觸發(fā)的Jak-Stat信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。SHP2可促進(jìn)RAS的激活，其確切機(jī)制不明[9]。

研究[10]表明，SHP2是青少年粒-單核細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞性白血病、慢性粒-單核細(xì)胞性白血病的病因，在乳腺癌中表達(dá)率較高，與幽門螺旋桿菌相關(guān)胃癌的發(fā)生相關(guān)，有關(guān)SHP2在肺癌組織中的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)較少。本研究表明，SHP2在肺癌組織中陽(yáng)性率較高，最近國(guó)內(nèi)的一個(gè)課題組也得出類似的結(jié)果[11]。這一結(jié)果提示，SHP2在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用，其具體機(jī)制有待深入研究。已知EGFR基因突變和KRAS基因突變是肺癌發(fā)病機(jī)制中最重要的兩個(gè)突變[7]，可以通過(guò)檢測(cè)肺癌組織中EGFR基因擴(kuò)增或突變、RAS基因突變與SHP2的PTPN11基因擴(kuò)增或突變之間的關(guān)系，從而確定在肺癌發(fā)病過(guò)程中SHP2是否及如何發(fā)揮重要作用。

目前，以蛋白酪氨酸激酶為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)已成為NSCLC治療的研究熱點(diǎn)之一，而SHP2作為蛋白酪氨酸磷酸酶的家族成員之一，在多種細(xì)胞信號(hào)通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用[12]，其異常表達(dá)可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，所以完全具備作為藥物作用靶點(diǎn)開發(fā)的條件，本課題為這一方面的研究提供了新的依據(jù)。SCLC對(duì)放療和化療頗為敏感但很難治愈，而以SHP2為靶點(diǎn)研發(fā)新藥為SCLC的藥物治療提供了新的思路。

磷酸化酪氨酸在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平較高[13]，蛋白酪氨酸磷酸酶TEP1在肺癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)低于良性病變的肺組織[14]，而本研究中蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在肺癌組織中的表達(dá)顯著增高。作者認(rèn)為，肺癌組織中的磷酸化酪氨酸水平反應(yīng)了整個(gè)酪氨酸磷酸酶的功能狀態(tài)，可以通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)SHP2的磷酸酶活性與磷酸化酪氨酸水平之間的相關(guān)性以了解SHP2對(duì)肺癌組織中酪氨酸磷酸化水平的影響。