周 娜，杜永成，張新日

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，太原 030001)

研究報告

鹽酸氨溴索聯(lián)合布地奈德對致敏大鼠氣道炎癥及肺組織氧化應(yīng)激水平的影響

周 娜，杜永成，張新日

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，太原 030001)

目的 觀察鹽酸氨溴索聯(lián)合吸入布地奈德對致敏大鼠氣道炎癥及肺組織氧化應(yīng)激水平的影響。方法32只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、致敏組、布地奈德干預(yù)組(BUD)和氨溴索+布地奈德干預(yù)組(AMB+ BUD)。測定各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(ABLF)細胞計數(shù)及分類;取部分肺組織行HE染色病理學(xué)觀察;測定肺組織中活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)含量。結(jié)果BUD+AMB組BALF中細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)以及肺組織ROS含量均明顯低于BUD組(P＜0.05，P＜0.01)，而肺組織GSH含量明顯高于BUD組(P＜0.01);同時BUD+AMB組大鼠支氣管壁炎癥反應(yīng)及病理損傷程度也較BUD組明顯減輕。相關(guān)性分析顯示:各組大鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)與肺組織ROS含量之間均呈正相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論氧化應(yīng)激在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。鹽酸氨溴索通過其抗炎、抗氧化作用，與吸入糖皮質(zhì)激素合用對哮喘急性發(fā)作有協(xié)同治療效果。

哮喘;布地奈德;鹽酸氨溴索;活性氧(ROS);谷胱甘肽(GSH)

支氣管哮喘(哮喘)是一種氣道慢性非特異性炎癥性疾病，病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘最有效的藥物，然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，部分哮喘患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療后，癥狀雖然得到良好的控制，但其體內(nèi)的活性氧水平依然很高，提示氧化應(yīng)激(oxidative stress)在哮喘發(fā)病中具有一定作用［1］。因此，聯(lián)合應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和抗氧化治療應(yīng)比單用激素療效更佳。本研究擬通過觀察鹽酸氨溴索聯(lián)合吸入布地奈德對致敏大鼠氣道炎癥及肺組織氧化應(yīng)激水平的影響，探討鹽酸氨溴索與吸入糖皮質(zhì)激素對哮喘協(xié)同治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組和哮喘模型的復(fù)制

健康雄性Wistar大鼠32只(由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號:山醫(yī)字第070101)，體重150～170 g，隨即分為4組(n=8)，參照文獻［2］報道方法并加以改進復(fù)制哮喘模型。①對照組:第1天和第8天腹腔注射生理鹽水各1 mL，第15天霧化生理鹽水，每天1次，每次30 min。②致敏組:第1天和第8天腹腔注射10%OVA各1 mL (包括卵白蛋白100 mg、氫氧化鋁100 mg)，第15天開始霧化1%OVA，療程同前，以初次霧化后出現(xiàn)點頭運動、腹肌收縮為哮喘發(fā)作標(biāo)志。③布地奈德干預(yù)(BUD)組:給藥方法基本同致敏組，所不同的是每次霧化OVA前1h吸入0.02%布地奈德30 min。④氨溴索+布地奈德干預(yù)(AMB+BUD)組:給藥方法基本同BUD組，所不同的是每次吸入布地奈德前25 min腹腔注射鹽酸氨溴索(勃林格殷格翰公司產(chǎn)品)，劑量為60 mg/kg。各組總療程均為10周。

1.2 標(biāo)本采集與制作

療程結(jié)束后頸動脈放血處死動物，結(jié)扎右主支氣管，對左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)(3 mL×4次)，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，回收率60%～80%。取右肺部分組織用中性甲醛液固定，行普通病理學(xué)檢查;剩余肺組織置于液氮中速凍，用以測定肺組織ROS和GSH含量。

1.3 BALF細胞計數(shù)及分類

將肺泡灌洗液注入離心管中，1 500 r/min離心15 min，移去上清液，留0.5 mL沉渣，沉渣即刻推片，吹干行HE染色，在高倍鏡下至少計數(shù)300個細胞并分類。

1.4 肺組織病理學(xué)檢查

切片行蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察。

1.5 肺組織中ROS、總GSH含量的測定

取肺組織0.1 g，加入預(yù)冷的0.9 mL生理鹽水，在冰上碾成勻漿，離心取上清液。測定方法按試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS12.0軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異的顯著性用方差分析，兩兩比較用 SNK－q檢驗法，相關(guān)關(guān)系用直線相關(guān)分析，以P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)及分類

各組大鼠 BALF細胞計數(shù)及分類結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，BUD和BUD+AMB組BALF細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞數(shù)及淋巴細胞數(shù)雖明顯高于對照組(均P＜0.01)，但均較致敏組明顯降低(均P＜0.05); BUD+AMB組BALF細胞總數(shù)、嗜酸粒細胞數(shù)及淋巴細胞數(shù)均明顯低于BUD組(均P＜0.05)。

表1 BALF中細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較 (n=8，±s)(×107/L)Tab.1 The total cell number and numbers of different types of cells in the bronchoalveolar lavage fluid

表1 BALF中細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較 (n=8，±s)(×107/L)Tab.1 The total cell number and numbers of different types of cells in the bronchoalveolar lavage fluid

與正常對照組相比，*P＜0.05;與致敏組相比，#P＜0.05;與BUD組相比，△P＜0.05*P＜0.05，compared with the normal control;#P＜0.05，compared with the allergized group;△P＜0.05，compared with the BUD group.

組別Group細胞總數(shù)The total cell count淋巴細胞數(shù)Lymphocyte count嗜酸粒細胞數(shù)Eosinophil count正常對照組 Normal control 17.01±1.83 3.95±0.84 0.12±0.01致敏組 Allergized group 99.16±4.38*35.97±3.85*16.04±1.37*BUD組 BUD group 45.72±3.59*#15.67±1.27*#3.89±0.53*#BUD+AMB組 BUD+AMB group 30.95±2.68*#△8.91±1.20*#△1.51±0.21*#△

2.2 肺組織HE染色

HE染色光鏡下觀察，對照組大鼠支氣管黏膜上皮及黏膜肌層完好，支氣管管腔規(guī)則，周圍無炎癥細胞浸潤;致敏組大鼠支氣管上皮細胞腫脹、脫落，氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增厚，支氣管呈收縮狀態(tài)，管壁增厚，管腔變窄，管壁內(nèi)及管周有大量以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤。藥物干預(yù)后，BUD+AMB組和BUD組大鼠支氣管壁炎癥反應(yīng)及損傷程度均較致敏組明顯減輕，其中以BUD+AMB組更為顯著(圖1～4，見彩插4)。

2.3 肺組織中ROS、GSH的含量

各組大鼠肺組織ROS及GSH含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，肺組織ROS含量從高到低依次為致敏組、BUD組、BUD+AMB組和對照組，GSH含量從低到高依次為致敏組、BUD組、BUD+AMB組和對照組，組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義 (均 P＜0.01)。

表2 大鼠肺組織ROS及GSH含量(n=8，±s)Tab.2 The ROS and GSH levels in the lung tissue of rats(n=8，±s)

表2 大鼠肺組織ROS及GSH含量(n=8，±s)Tab.2 The ROS and GSH levels in the lung tissue of rats(n=8，±s)

備注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與致敏組比較#P＜0.01;與BUD組比較，△P＜0.01*P＜0.05，compared with the normal control;#P＜0.05，compared with the allergized group; △P＜0.05，compared with the BUD group.

組別Group活性氧ROS (U/mg pro)谷胱甘肽GSH (μmol/L)正 常 對 照 組Normal control 1517±152 1.69±0.10致敏組 Allergized group 5272±248*0.42±0.06*BUD組 BUD group 3518±203*#0.86±0.10*#AMB+BUD組BUD+ AMB group 2457±176*#△1.23±0.076*#△

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果直線相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)與肺組織 ROS含量之間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.931、0.898和0.935(均P＜0.05)。

3 討論

目前認為哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥，其最有效的抗炎藥是糖皮質(zhì)激素。但臨床上有部分患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后，病情仍得不到有效控制，說明除了炎癥機制外還有其他因素參與了哮喘的發(fā)病過程，其中氧化應(yīng)激(oxidative stress)在哮喘發(fā)病中的作用日益受到人們的關(guān)注。

研究表明，氣道是暴露在高氧化物和抗氧化物環(huán)境中的唯一器官。氣道中的氧化物主要是活化氧和活化氮(ROS/RNS)。ROS包括過氧化物、過氧化氫及羥自由基等。RNS包括NO及其衍生物?？寡趸锓譃榭寡趸?如SOD家族)和非酶學(xué)抗氧化劑(如谷胱甘肽等)。正常狀態(tài)下，氧化物和抗氧化物保持相對平衡狀態(tài)，這對保護氣道的正常功能是非常必要的。當(dāng)氣道暴露于各種煙塵、細菌、病毒及污染的環(huán)境時，這種平衡狀態(tài)即可被打破，大量ROS不但可導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)變性，而且可破壞核酸和染色體，從而引起氣道黏膜氧化性損傷。

氧化應(yīng)激與哮喘的相關(guān)性是肯定的，但與哮喘嚴(yán)重程度是否存在相關(guān)性目前尚有爭議。Nadeem等的研究表明，哮喘患者氧化應(yīng)激和抗氧化能力與其疾病的嚴(yán)重程度無顯著相關(guān)性［3］。Picado等的研究發(fā)現(xiàn)，除了 GSH－Px外，其它諸如維生素 A、C、E以及錳、鋅、硒等均與哮喘嚴(yán)重程度無關(guān)［4］。但上述研究均未包括哮喘急性發(fā)作期患者。最近Nadeem等對急性發(fā)作期患者與穩(wěn)定期患者進行了比較研究發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期患者 MDA比穩(wěn)定期患者明顯增高，總抗氧化能力及蛋白疏基水平比穩(wěn)定期患者明顯降低，而、蛋白羰基、NOX、GSHPx、SOD、CAT及總GSH二者差異無顯著［5］。

本研究結(jié)果表明，致敏組大鼠肺組織ROS較對照組明顯升高，而還原型GSH較對照組明顯降低。光鏡下觀察，致敏組大鼠支氣管上皮細胞較對照組明顯腫脹、脫落，氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增厚，以致管壁增厚，管腔變窄，管壁內(nèi)及管周有大量以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，而且肺組織ROS水平與BALF中嗜酸粒細胞數(shù)及淋巴細胞數(shù)均呈正相關(guān)。提示氧化應(yīng)激參與了哮喘的發(fā)病過程，氧化應(yīng)激水平的高低與哮喘嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。因此，對哮喘急性發(fā)作期患者同時給予抗氧化治療有望成為預(yù)防和治療哮喘的一種方法。

鹽酸氨溴索(AMB)是一種較新的粘液溶解劑，近年來許多研究都證明 AMB還有明顯的抗氧化的作用。Gillissen等［6］以乙酰半胱氨酸(NAC)和AMB作比較，研究它們清除氧自由基的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均可以清除OH－和HOCl，此外AMB還能降低氣道高反應(yīng)性，促進細胞表面活性物質(zhì)合成。有人用AMB對體外培養(yǎng)的單核細胞及多形核細胞進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)AMB能直接清除反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物，其抗氧化效果可能與炎性細胞的氧化前代謝減弱有關(guān)［7］。Teramoto等［8］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞產(chǎn)生的過氧化物和 H2O2可以被 AMB以劑量依賴性方式所抑制，其機制尚不清楚，可能與細胞內(nèi)鈣離子濃度改變有關(guān)。本研究結(jié)果表明，AMB聯(lián)合BUD干預(yù)組大鼠BALF中嗜酸粒細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)以及肺組織 ROS含量較 BUD組明顯降低，而GSH含量明顯增加;同時氣道炎癥損傷程度也較BUD組明顯減輕。說明AMB與吸入糖皮質(zhì)激素對哮喘急性發(fā)作具有協(xié)同治療作用。

AMB對哮喘的治療作用不僅表現(xiàn)在抗氧化方面，其抗炎作用也不能忽視。許多研究表明，AMB能減少炎性介質(zhì)的釋放。Park等［9］研究發(fā)現(xiàn)，AMB可抑制人白細胞和肥大細胞釋放組織胺、白三烯和細胞因子。Pfeifer等［10］將外周血單核細胞及活化的BALF細胞與不同濃度的AMB一起在體外進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AMB干預(yù)組細胞培養(yǎng)液中 TNF－a、IL－2及干擾素－a含量較對照組明顯降低。說明AMB在體內(nèi)達到一定濃度時具有明顯的抗炎能力，但其作用機制尚不清楚。

綜上所述，氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病中起著重要作用。內(nèi)源和外源性ROS使機體氧化與抗氧化能力失平衡而產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，不但能促進肺組織局部的炎癥反應(yīng)，而且可削弱糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)，是形成頑固性或難治性哮喘的主要原因之一。因此，這類患者在吸入糖皮質(zhì)激素的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加用抗氧化藥物治療有一定益處。

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The Effect of Ambroxol Hydrochloride Combined with Budesonide Suspension on Airway Inflammation and Oxidative Stress in Rats with Asthma

ZHOU Na，DU Yong－cheng，ZHANG Xin－ri
(The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ambroxol hydrochloride combined with Budesonide suspension on airway inflammation and levels of oxidative stress in the lung of rats with asthma。MethodsThirty－two male Wistar rats were divided randomly into a control group，a sensitized group，a Budesonide suspension－treated group(BUD)and a group treated by ambroxol hydrochloride combined with Budesonide Suspension(AMB+BUD).The cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of each group was classified and counted.The lung tissue was pathologically observed with hematoxylin and eosin staining，and the levels of ROS and GSH in the lung were measured respectively。ResultsThe number of total cells，lymphocytes and eosinocytes in the BALF as well as the lung tissue ROS levels were significantly lower in AMB+BUD group than in the BUD group(P＜0.05，P＜0.01)，while the lung tissue GSH was significantly higher than that in the BUD group(P＜0.01).Compared with BUD group，the degree of airway inflammatory reaction and pathological damage were significantly weaker in the AMB+BUD group.Linear correlation analysis indicated that there was positive correlation between the level of ROS and the total cell，lymphocyte and eosinocyte counts(P＜0.05)。Conclusions

Oxidative stress plays an important role in the morbility of asthma.Ambroxol，through its anti－inflammatory，antioxidationation，combined with inhaled corticosteroids has a synergistic therapeutic effect on acute asthma attack.

Asthma;Budesonide suspension;Ambroxol hydrochloride;ROS;GSH;Rats

R－33

A

1671－7856(2010)04－0046－04

2010－01－18

周娜(1983－)，女，碩士生，研究方向:哮喘與氧化應(yīng)激。E－mail:tianya855@163.com。

杜永成，男，院長兼呼吸內(nèi)科主任，醫(yī)學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師。E－mail:hxkdyc@yahoo.com.cn。