湯磊，劉本

(1.浙江大學寧波理工學院生化分院，浙江寧波 315100;2.浙江大學材料與化學工程學院，浙江杭州 310027)

響應面法優(yōu)化白芍中芍藥苷的超臨界流體提取研究

湯磊1，2，劉本1*

(1.浙江大學寧波理工學院生化分院，浙江寧波 315100;2.浙江大學材料與化學工程學院，浙江杭州 310027)

芍藥苷;超臨界流體提取;響應曲面分析法;優(yōu)化提取條件

目的:研究芍藥苷的最佳超臨界流體提取條件。方法:根據(jù)Box－Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應曲面分析法，建立白芍中芍藥苷超臨界流體提取的二次多項式數(shù)學模型，并以芍藥苷提取率為響應值作響應面和等高線，考察萃取壓力、萃取溫度和甲醇濃度對芍藥苷超臨界提取的影響。結(jié)果:芍藥苷超臨界流體提取的優(yōu)化工藝條件為:萃取壓力為18.9 MPa，萃取溫度為59.9℃，夾帶劑甲醇濃度為68.5%，夾帶劑流速0.4 mL/min，萃取時間為60 min。結(jié)論:在此提取條件下，芍藥苷的理論提取率可達7.85 mg/g。

KEY WORDS:paeoniflorin;supercritical fluid extraction(SFE);response surface methodology(RSM);optimization of extraction condition

ABSTRACT:AIM:To develop a method for optimizing of supercritical fluid extraction(SFE)of paeoniflorin. METHODS:On the basis of one－factor test and the Box－Behnken central－composite design response surface with 3 factors and 3 levels was adopted.A second order quadratic equation for SFE of paeoniflorin was built.Response surface and contour were graphed with the extraction rate of paeoniflorin as the response value.Based on the analysis of the response surface plots and their corresponding contour plots，the effects of extraction pressure，extraction temperature，and methanol concentration were explored.RESULTS:By using the new method discussed above，the optimum extraction condition was obtained as follows:18.9 MPa extraction pressure，extraction cosolvent temperature 59.9℃，68.5%methanol was chosen as cosolvent with the flow rate of 0.4 mL/min，and extraction time 60 min.CONCLUSION:Under the optimized condition，extraction rate of paeoniflorin on theoretical value is 7.85 mg/g.

白芍為毛茛科植物毛果芍藥(Paeonia lactifra Pall)的干燥根。性微寒、味苦、酸。具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗之功效，用于頭暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛，血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗［1］。白芍中的主要有效部位為白芍總苷，而其中有效成分芍藥苷(Paeoniflorin)約占70%以上［2］，具有擴張冠狀動脈，增加冠脈流量，對抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血壓等藥理作用［3，4］。白芍中芍藥苷的定量檢測通常采用高效液相色譜法［5，6］。對白芍藥材中芍藥苷的提取采用的方法有水、乙醇［5，7］、正丁醇和甲醇［8］，也有文獻用超聲提取法提取白芍中芍藥苷［9］，但未見有用超臨界流體提取技術(shù)(SFE)提取該成分的報道。

響應曲面方法(RSM)方法是其以回歸模型作為函數(shù)估算的工具，將因子與試驗結(jié)果(響應值)的相互關(guān)系用多項式擬合，研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互作用關(guān)系，并進行優(yōu)化，是一種優(yōu)化考察條件和加工工藝參數(shù)的有效方法［10］。本研究將其應用到白芍中芍藥苷的超臨界流體提取中，優(yōu)化了提取條件。

1 材料與儀器

1.1 實驗設(shè)備高效液相色譜儀(型號L－2400，日本日立公司(Hitachi));自動雙重純水蒸餾器(型號SZ－93，上海亞榮生化設(shè)備廠);萬分之一電子天平(型號AL204，Mettler－Toledo Group);高速萬能粉碎機(型號DJ靈巧型，天津市泰斯特儀器公司);超臨界流體萃取儀(Spe－ed SFE，Applied Separations. Inc.(U.S.A));藥典4號檢驗篩(浙江省上虞市紗篩廠)。

1.2 實驗原料與試劑白芍購自北京同仁堂，產(chǎn)地安徽，經(jīng)浙江大學寧波理工學院生化分院劉本教授鑒定;芍藥苷標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110736);蒸餾水為雙蒸水;工業(yè)液體CO2(純度＞99.0%，寧波方辛氣體公司);其它試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的制備稱取4 mg芍藥苷標準品于10 mL量瓶中，加入甲醇適量，待完全溶解后定容至10 mL，配制濃度范圍為5～100 μg/mL的溶液。在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線為:y=35 811x－9 586.8，R2=0.999 0。

2.2 樣品處理將購得的白芍飲片經(jīng)粉碎，過4號篩。取一份0.5 g該粉末與1.5 g硅藻土混合均勻，得樣品，備用。

2.3 白芍中芍藥苷的超臨界流體提取將以上樣品裝入提取池，空體積用硅藻土填滿。將提取池與超臨界流體萃取裝置連接，進行提取。提取條件為:靜態(tài)萃取時間10 min，動態(tài)萃取時間30～120 min;壓力15～30 MPa;溫度50～70℃;CO2流速2 L/ min;夾帶劑流量0.4 mL/min。提取物用裝有5 mL甲醇的收集瓶收集。萃取結(jié)束后轉(zhuǎn)入50 mL量瓶，用體積分數(shù)為40%的甲醇溶液定容至刻度，取1 mL溶液轉(zhuǎn)入10 mL量瓶，并再次定容至刻度。該溶液用于HPLC分析。

2.4 HPLC條件ODS柱Diamond C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm，迪馬公司);檢測波長為230 nm［11］，流速為1.0 mL/min，流動相(甲醇－水=40∶60)，固定進樣量20 μL。所有對照品和樣品溶液進行HPLC分析前用0.45 μm濾膜過濾。

2.5 數(shù)據(jù)分析利用Design－Expert(version7.0，Stat－Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA)軟件進行響應面實驗設(shè)計，數(shù)據(jù)分析和繪圖(圖1)。

圖1 芍藥苷標準品及白芍超臨界流體提取樣品HPLC圖A.芍藥苷標準品B.白芍超臨界流體提取樣品1.芍藥苷

3 結(jié)果與討論

3.1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、甲醇濃度對芍藥苷提取率的單因素影響試驗影響芍藥苷超臨界提取的提取率的因素很多，如萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑及流速、CO2流速等。在做RSM分析前，應先通過單因素試驗來選取試驗因素與水平。

3.1.1 萃取壓力固定萃取溫度為60℃，萃取時間為60 min，夾帶劑是體積分數(shù)為80%的甲醇，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取壓力對芍藥苷超臨界提取的提取率的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著萃取壓力的升高，芍藥苷提取率有一定提高。芍藥苷提取率在25 MPa前增加較為明顯，以后成緩慢下降趨勢。為減少能耗，選擇萃取壓力為20～30 MPa為宜。

圖2 萃取壓力對芍藥苷提取率的影響(n=3)

3.1.2 萃取溫度固定萃取壓力為25 MPa，萃取時間為60 min，夾帶劑為80%甲醇，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取溫度對芍藥苷超臨界提取的提取率的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在萃取壓力為25 MPa，萃取時間為60 min，夾帶劑為80%甲醇，當萃取溫度在40～60℃時，芍藥苷提取率有顯著的提高，并在60℃左右達到最高，繼續(xù)提高溫度，芍藥苷的提取率則有明顯下降的趨勢，故選擇萃取溫度范圍在50～70℃之間。

圖3 萃取溫度對芍藥苷提取率的影響(n=3)

3.1.3 萃取時間固定萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為60℃，萃取時間為60 min，夾帶劑為80%甲醇，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取溫度對芍藥苷超臨界提取的提取率的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，在60 min內(nèi)，芍藥苷提取率隨時間迅速提高，之后隨萃取時間的延長，提取率增加緩慢。綜合考慮原料本身芍藥苷含量及成本，選擇萃取時間為60 min為宜。

圖4 萃取時間對芍藥苷提取率的影響(n=3)

3.1.4 夾帶劑種類固定萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為60℃，萃取時間為60 min，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同夾帶劑種類對芍藥苷提取率的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，當夾帶劑為甲醇時，不同甲醇濃度對芍藥苷提取率有較為顯著的影響，在甲醇體積分數(shù)在20%～80%范圍內(nèi)時，提取率隨甲醇濃度增加緩慢增加，在80%時達到最高提取率，而進一步增加甲醇濃度，提取率迅速下降。

圖5 夾帶劑對芍藥苷提取率的影響(n=3)

當夾帶劑為雙蒸水時，其提取率僅比20%甲醇濃度的稍高，達5.84 mg/g，分析其主要原因可能是，甲醇體積分數(shù)較低時使大量雜質(zhì)溶出，使得提取液變得黏稠，并對芍藥苷產(chǎn)生吸附作用，不利于芍藥苷的快速擴散溶出［12］;根據(jù)單因素試驗結(jié)果，當甲醇體積分數(shù)較高(＞90%)時，提取率也很低。同時本實驗也對比了在無夾帶劑情況下芍藥苷的超臨界流體提取，提取率極低，考慮甲醇濃度對提取率有較大影響，故選取甲醇體積分數(shù)在60%～100%范圍。

3.2 采用響應曲面法優(yōu)化芍藥苷超臨界流體提取工藝

3.2.1 響應曲面分析因素水平的選取根據(jù)Box－Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，結(jié)合上述單因素影響試驗結(jié)果，固定萃取時間為60 min，選取萃取壓力、萃取溫度和甲醇濃度3個影響因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應曲面分析方法，試驗因素與水平設(shè)計見表1，共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為零點，零點試驗進行了3次，以估計誤差。

表1 白芍苷超臨界流體提取試驗的因素與水平

3.2.2 響應曲面分析方案及結(jié)果先對萃取壓力(Z1)、萃取溫度(Z2)和甲醇濃度(Z3)進行編碼:

式中，xi為各參數(shù)的編碼值，Zi為各參數(shù)的真實值，Z0為試驗中心點處各參數(shù)的真實值，Z為各參數(shù)的變化步長，以芍藥苷提取率為響應值(y)。芍藥苷超臨界流體提取響應曲面分析試驗設(shè)計方案與試驗結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷超臨界流體提取試驗設(shè)計與試驗結(jié)果

3.2.3 實驗數(shù)據(jù)分析實驗數(shù)據(jù)分析采用Design－Expert軟件(version7.0，Stat－Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA)進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到以芍藥苷提取率為目標函數(shù)，關(guān)于各條件編碼值的二次回歸方程為:

式中，萃取壓力、萃取溫度、甲醇濃度在分析中均經(jīng)過線性編碼處理，分別對應x1、x2、x3。因此，方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各提取因素對響應值的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。由回歸方程知，夾帶劑甲醇濃度的線性項以及它的二次項對提取率的影響非常顯著。

對該模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表3 芍藥苷超臨界流體提取回歸模型的方差分析結(jié)果

表4 芍藥苷超臨界流體提取回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

由表3可知，模型的P值為0.000 2，遠小于0.01，說明該模型極顯著;其中R2=98.93%，表明98.93%的實驗數(shù)據(jù)可用該模型進行解釋，說明方程可靠性較高。RSD值越低，顯示實驗穩(wěn)定性越好，本實驗中RSD值為8.68%，較低，說明實驗操作穩(wěn)定性較好。故該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以此模型來分析和預測超臨界流體提取芍藥苷的工藝結(jié)果。

由表4可知，回歸方程的一次項x1，x2不顯著，x3極顯著;二次項x21和x22不顯著，x23極顯著;交互項均不顯著;表明夾帶劑甲醇濃度對芍藥苷的超臨界流體提取具有極大的影響，而萃取壓力和萃取溫度的影響均不明顯，故各因素對芍藥苷提取率的影響可以近似為線性關(guān)系。

3.2.4 芍藥苷超臨界提取工藝的響應面分析

圖6 芍藥苷超臨界提取過程中萃取壓力、萃取溫度及其交互作用對提取率影響的響應曲面

圖7 芍藥苷超臨界提取過程中萃取壓力、甲醇濃度及其交互作用對提取率影響的響應曲面

圖8 芍藥苷超臨界提取過程中萃取溫度、甲醇濃度及其交互作用對提取率影響的響應曲面

由圖7可以看出，萃取壓力(Z1)和甲醇濃度(Z3)之間以及萃取溫度(Z2)與甲醇濃度(Z3)之間的交互作用較明顯，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。相比較而言，萃取壓力(Z1)和萃取溫度(Z2)之間的交互作用不明顯。

由以上3組圖可知，夾帶劑甲醇濃度對芍藥苷提取率的影響最為顯著，曲線變化明顯，由圖可看出甲醇濃度最優(yōu)值在70%附近;而萃取壓力和萃取溫度對芍藥苷提取率的影響不明顯，曲線變化較為平緩，響應值變化不明顯。

為得出最優(yōu)提取工藝條件，于是將回歸模型取一階偏導令其等于零，解關(guān)于x1、x2、x3的三元一次方程組，可以得到:x1=－1.216 8，x2=－0.005 8，x3=－0.577 3。變換為真實值可得:萃取壓力為18.9 MPa，萃取溫度為59.9℃，甲醇濃度為68.5%，在此條件下，芍藥苷提取率理論值可達到7.85 mg/g。

為驗證響應曲面法所得結(jié)果的可靠性，在上述優(yōu)化提取條件進行芍藥苷的超臨界流體提取，在提取之前，為了實際的可操作性，將優(yōu)化提取工藝參數(shù)進行修正:萃取壓力19 MPa，萃取溫度60℃，甲醇濃度70%，靜態(tài)萃取時間10 min，動態(tài)萃取時間60 min，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min。在此條件下平行提取3次，實際測得的平均提取率為7.48 mg/g，與理論預測值相比，其相對誤差約為4.71%。

3.3 不同提取方法的比較分別采用不同提取方法來提取白芍中的芍藥苷，并將提取結(jié)果做一比較。

表5 不同提取方法的比較

從表5可以看出，以上各提取方法中SFE具有提取時間短、效率高等優(yōu)點，整體上優(yōu)于索氏提取和超聲提取。

4 結(jié)論

1)采用響應面試驗設(shè)計方法得出的芍藥苷超臨界流體提取工藝參數(shù)的二次回歸方程為:

方差分析結(jié)果表明:模型的P值為0.000 2，遠小于0.01，表明回歸模型極顯著;其中R2=98. 93%，說明該方程能較好的預測芍藥苷超臨界流體提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

2)利用回歸方程得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為:萃取壓力18.9 MPa，萃取溫度59.9℃，甲醇濃度68.5%，靜態(tài)萃取時間10 min，動態(tài)萃取時間60 min，夾帶劑流速為0.4 mL/min，CO2流速2 L/min?？紤]到實際操作的便利，對此條件進行適當修正后進行平行3次提取驗證實驗，得到芍藥苷平均提取率為7.48 mg/g。本研究還對比了索氏提取及超聲提取，其結(jié)果表明SFE提取具有提取時間短、效率高等優(yōu)點，整體上優(yōu)于索氏提取和超聲提取。因此，利用響應面分析方法對芍藥苷超臨界流體提取工藝進行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的提取參數(shù)，能有效降低提取條件組合的復雜性，為進一步工藝研究奠定基礎(chǔ)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:68.

［2］張曉燕，王金輝，李銑.白芍的化學成分研究［J］.沈陽藥科大學學報，2001，18(1):30.

［3］劉鷹翔，馬玉卓.白芍化學成分與藥理研究進展［J］.中草藥，1995，26(8):437.

［4］祝曉光，韋穎梅，劉桂蘭，等.白芍總苷對急性心肌缺血的保護作用［J］.中國藥理學通報，1999，15(3):252.

［5］劉芳，楊廣德.白芍中芍藥苷的提取方法研究［J］.中成藥，2003，25(10):792－794.

［6］王杰民，何懷冰，竺葉青，等.芍藥中芍藥甙的高效液相色譜法測定［J］.中成藥，1991，13(4):32.

［7］吳巧鳳，嚴云良，樓小紅.白芍中芍藥苷的提取工藝研究［J］.中成藥，2006，28(9):1379－1380.

［8］劉玉紅，陳燕，易進海.不同提取溶劑對白芍中芍藥苷含量測定結(jié)果的影響［J］.基層中藥雜志，2001，15(5):19.

［9］林慶義，汪世瓊.白芍超聲提取工藝研究［J］.中藥材，2002，25(10):737.

［10］慕運動.響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用［J］.鄭州工程學院學報，2001，22(3):91.

［11］李越峰，嚴興科，沈菲，等.白芍HPLC指紋圖譜相似度的分析研究［J］.中成藥，2008，30(7):942－945.

［12］曾寶，黃曉其，易智彪，等.芍藥苷在生產(chǎn)工藝過程中的含量變化和影響因素研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(14): 1473.

Optimization of supercritical fluid extraction of paeoniflorin by response surface methodology

TANG Lei1，2，LIU Ben1

(1.Department of Biological and Chemical Engineering，Ningbo Institute of Technology，Zhejiang University，Ningbo 315100，China;2.College of Materials Science and Chemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

R284.2

A

1001－1528(2010)08－1332－06

2009－07－15

寧波市教育局資助項目(Jd070204，Jd090222)

湯磊(1984－)，男(回族)，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物活性成分的提取與分離研究。Tel:13136379099 E－mail:tanglei198422@ 163.com

*通訊作者:劉本，教授，Tel:0574－88130089 E－mail:liuben@nit.zju.edu.cn