黃翠琴，廖生錢(qián)，王壽昆，黃其春，鄭新添，朱興全

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000；2.龍巖學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364000；3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046)

豬蛔蟲(chóng)病呈世界性流行，豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重[1-2]，其發(fā)育具有明顯的期特異性[3]。本實(shí)驗(yàn)從前期構(gòu)建的豬蛔蟲(chóng)感染期幼蟲(chóng)差異消減cDNA文庫(kù)中篩選基因28A02(ES291024)[4]，采用半定量RT-PCR方法分析該基因在豬蛔蟲(chóng)不同發(fā)育期的表達(dá)情況，并采用RACE技術(shù)擴(kuò)增其全長(zhǎng)cDNA序列，為尋找豬蛔蟲(chóng)病免疫防治的靶分子奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料 豬蛔蟲(chóng)采自福建省龍巖市某屠宰場(chǎng)。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑購(gòu)自北京天根有限公司；ReverTra Ace-α-TM試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；r Taq酶購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；5'-Full RACE試劑盒、3'-Full RACE試劑盒和DNA Ligation試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 豬蛔蟲(chóng)不同發(fā)育期幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的收集與總RNA的提取 參照文獻(xiàn)[4]的方法對(duì)豬蛔蟲(chóng)不同發(fā)育期幼蟲(chóng)及成蟲(chóng)進(jìn)行收集，保存于液氮中備用。

按 TRIzol說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體總 RNA，取 5μL RNA溶液于瓊脂糖凝膠中檢測(cè)，剩余的RNA溶液貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 半定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)及28A02基因在不同發(fā)育期的表達(dá)分析 參照ReverTra Ace-α-TM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA初始量均為1μg。內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增引物及條件按文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。以已知的28A02EST序列為模板設(shè)計(jì)引物：上游引物5'-ATTGCCGAAAGGAAAGCG-3'，下游引物5'-CCACCATTCTAACATAACCACC-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

優(yōu)化Mg2+濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)，選擇最佳的PCR反應(yīng)條件對(duì)感染期幼蟲(chóng)差異表達(dá)基因在不同發(fā)育期的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。在同一次PCR反應(yīng)中，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One軟件在波長(zhǎng)302nm對(duì)電泳條帶進(jìn)行光密度測(cè)定，以28A02基因和內(nèi)參基因β-actin的積分光密度比值(IOD)代表28A02基因的mRNA的含量。RT-PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知EST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 RACE擴(kuò)增

1.5.13'RACE擴(kuò)增及序列分析參照3'-Full RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)上游引物F0：5'-AGACCTCATCCAGGCGGT GTTCC-3'和巢式引物 F：5'-ATTGCCGAAAGGAA AGCG-3'。進(jìn)行3'端序列PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5.25'RACE擴(kuò)增及序列分析參照5'-Full RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)總RNA進(jìn)行CIAP、TAP處理，并與5'RACE Adaptor連接，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別設(shè)計(jì)引物R：5'-CCACCATTCTAACATAACCACC-3'和巢式引物 R1：5'-GTCTGCTTCCTGACCTCGCTC TTC-3'。進(jìn)行5'端序列PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5.33'RACE和5'RACE序列拼接和驗(yàn)證根據(jù)擴(kuò)增得到的5'端和3'端序列，拼接全長(zhǎng)基因，以該全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物：F2：5'-GTTTAATTACCCAAGTT TGAG-3'； R3： 5'-TATAAAGAAAACATGGCACTA C-3'；使用TaKaRa LA Taq酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證5'和3'RACE拼接序列。

1.6 生物信息學(xué)分析 將獲得的全長(zhǎng)cDNA序列在NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析和編碼蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)，獲得相關(guān)的生物學(xué)信息。

2 結(jié)果與討論

2.128 A02基因在不同發(fā)育期的表達(dá)分析 內(nèi)參基因β-actin和目的基因28A02PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測(cè)，用Quantity One軟件對(duì)每條電泳條帶進(jìn)行光密度測(cè)定，用目的基因和內(nèi)參基因的(IOD)代表目的基因在不同發(fā)育期的表達(dá)量。結(jié)果表明，該基因在感染期幼蟲(chóng)呈高豐度表達(dá)外，在肺期幼蟲(chóng)有少量表達(dá)，在其它發(fā)育期均不表達(dá)(表1)。

表1 β-actin和28A02PCR產(chǎn)物電泳相應(yīng)條帶的IODTable 1The IOD of the PCR product of 28A02gene and β-actin in different developmental stages of A.suum

2.23 'RACE和5'RACE擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)3'RACE和5'RACE擴(kuò)增后，分別取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約500bp的3'末端片段和大小約300bp的5'末端片段(圖1)。

2.33'RACE和5'RACE拼接驗(yàn)證結(jié)果及分析將3'RACE和5'RACE所得序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)為864bp的序列。根據(jù)獲得的5'端和3'端已知序列設(shè)計(jì)拼接引物，PCR擴(kuò)增后得到其中791bp序列(圖2)，經(jīng)測(cè)序與拼接的序列相同。該全長(zhǎng)序列含一個(gè)完整的長(zhǎng)為450bp開(kāi)發(fā)閱讀框(ORF)，序列兩端有長(zhǎng)為27bp的5'非編碼區(qū)(UTR)和長(zhǎng)為387bp并且?guī)в蠵oly(A)的3'UTR，編碼149個(gè)氨基酸，蛋白分子量為16.70ku。將該序列錄入GenBank，序列號(hào)為HM 147250。

2.428 A02基因的生物信息學(xué)分析 該基因編碼的氨基酸與Caenorhabditis briggsae的CBR-ATP-4protein具有47%的相似性，與秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的ATP合酶亞單位家族成員(atp-4)有45%的相似性。該基因編碼的蛋白同時(shí)存在疏水區(qū)和親水區(qū)，有6個(gè)保守的模體結(jié)構(gòu)，一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與線粒體的ATP合酶的偶聯(lián)因子有關(guān)。亞細(xì)胞定位分析顯示，該蛋白位于線粒體的可能性為73.9%，提示該基因極有可能編碼線粒體ATP合酶。

ATP合酶是熱休克蛋白90(HSP90)的協(xié)同作用蛋白。HSP的表達(dá)具有其特異性和溫度依賴(lài)性，豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)在發(fā)育移行過(guò)程中要經(jīng)歷溫度、滲透壓等變化，其過(guò)程受HSP的調(diào)控[6]。ATP合酶B亞基蛋白在能量代謝過(guò)程中起著獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用，能夠同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體，可作為抑制豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的關(guān)鍵靶分子[7]。豬蛔蟲(chóng)的感染性蟲(chóng)卵被宿主食入在小腸脫鞘后，經(jīng)肝、肺等一系列移行，該過(guò)程需要大量能量。上述推測(cè)提示ATP合酶可能參與幼蟲(chóng)的糖代謝過(guò)程，缺少ATP合酶可能使糖原的合成受阻，導(dǎo)致幼蟲(chóng)的發(fā)育停止或死亡。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究ATP合酶基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ho N F,Geary T G,Barsuhn C L,et al.Mechanistic studies in the transcuticular delivery of antiparasitic drugs.II:ex vivo/in vitro correlation of solute transport by Ascaris sunm[J].Mol Biochem Parasitol,1992,52(1):1-13.

[2]Martin R J,Murray I,Rodertson A P,et al.Anthelm intics and ion-channels:after a puncture,use a patch[J].Int J Parasitol,1998,28(6):849-862.

[3]Maung M.The occurrence of the second molt of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum[J].Int JParasitol,1978,8:371-378.

[4]Huang C Q,Gasser R B,Cantacessi C,et al.Genom ic-bioinformatic analysis of transcripts specific to the third-stage larva of the parasitic nematode Ascaris suum[J].PLoS Negl Trop Dis,2008,2(6):e246.

[5]Papathanassiu A E,MacDonald N J,Bencsura A,et al.F1F0-ATP synthase functions as a co-chaperone of Hsp90-substrate protein complexes[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,345(1):419-429.

[6]Devaney E,Martin S A,Thompsons F J.Stage-specific gene expression in lymphatic filarial nematodes[J].Parasitol Today,1996,12(11):418-424.

[7]周紅娟，余新炳，徐勁，等.華支睪吸蟲(chóng)ATP合酶B亞基全長(zhǎng)基因的生物信息學(xué)分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7(4)：315-318.