牛慶麗，關(guān)貴全，楊吉飛，付鈺廣，馬米玲，李有全，劉軍龍，郝雪峰，羅建勛，殷 宏

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046)

萊姆病(Lyme disease)又稱萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是一種經(jīng)蜱傳播的自然疫源性人獸共患病，因首次在美國康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)而得名[1]。病原體為伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，可分為13個(gè)基因型或組[2]。1982年，W illy等在美國首次從肩突硬蜱中分離出B.burgdorferi[4]，我國于1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，之后陸續(xù)報(bào)道的病原有狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋體(B.garinii)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)和法雷斯疏螺旋體(Borrelia valaisiana)共4個(gè)基因型[3]。到目前為止，我國29個(gè)省(區(qū)、市)均有人萊姆病的報(bào)道，每年新發(fā)病例高達(dá)萬余例。蜱是B.burgdorferi的傳播媒介和貯存宿主，在其叮咬吸血的過程中，將病原傳遞給脊椎動物。我國地域遼闊，不同地區(qū)蜱的種類及B.burgdorferi感染情況存在很大的差異，因此探明媒介蜱的種類在該病的防治中具有重要意義。

雖然在萊姆病的流行病學(xué)方面取得了一定的研究進(jìn)展，但是獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)不能確切反應(yīng)該病在我國的流行狀況。常規(guī)的細(xì)菌分離與鑒定、細(xì)菌抗原檢測等方法，對動物組織、血液以及傳播媒介蜱等菌體含量低微的樣品檢測時(shí)，往往得不到準(zhǔn)確的結(jié)果，容易漏檢。本研究從文獻(xiàn)[6-8]中用于擴(kuò)增B.burgdorferi OspA基因片段的3對引物中篩選出一對特異、敏感的引物，建立了PCR檢測方法，該方法具有高度的敏感性和特異性，并且操作簡便，適用于動物組織、血液及蜱體內(nèi)的病原檢測。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用B.burgdorferi標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA 分別從德國慕尼黑大學(xué)Max von pettenkofer研究所和荷蘭引進(jìn)14株B.burgdorferi基因組樣品，涵蓋了國內(nèi)分布的主要基因型，即：PKo(B.afzelii)、PKa(B.burgdorferi sensus stricto)、 T25(B.garinii)、 PBi(B.garinii)、PBr(B.garinii)、B31(B.burgdorferi sensus strict)、 20047(B.garinii)、IP90(B.garinii)、PFim(B.garinii)、Poti(B.garinii)、PTrob(B.garinii)、PHei(B.garinii)、PKab(B.garinii)和 TN(B.garinii)。

1.2 樣品采集 2009年4月～7月在福建省(南平市)、湖南省(懷化市)、廣東省(惠州市)、廣西壯族自治區(qū)(來賓市)、黑龍江省(尚志市)、吉林省(琿春市)和甘肅省(臨潭縣)的山區(qū)放養(yǎng)的牛羊身上采集寄生蜱共667只，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定為革蜱屬(264只)、血蜱屬(173只)、牛蜱屬(185只)和扇頭蜱屬(45只）。

1.3 主要試劑 Taq DNA聚合酶等購自TaKaRa公司，DNA提取試劑盒購自Gentra公司。

1.4 引物合成及篩選 按照文獻(xiàn)[6-8]設(shè)計(jì)3對通用引物，SL1PF：5'-AATAggTCTAATAATAgCCTTAA TAgC-3'， SL1PR： 5'-CTAgTgTTTTgCCATCTTCTTT gAAAA-3'； SL2PF： 5'-ggAAAAgCTAAAgAg[A]gTT TTAAAA-3'，SL2PR：5'-TTATTTTAAAgCgT[g]T[C]TTT-3'；SL3PF：5'-ggAAAAgCTAAAgAggTTTTAAA A-3'， SL3PR： 5'-TTATTTCAAAgCg-3'。 引 物 由TaKaRa公司合成，擴(kuò)增目的片段分別為307bp、316bp和 320bp。

1.5 基因組DNA的提取 按說明書DNA提取試劑盒提取667只蜱的DNA。

1.6 PCR的特異性試驗(yàn) 采 用 引 進(jìn) 的 14株B.burgdorferi基因組樣品和從健康牛羊血液、衣原體、支原體、牛無漿體、羊無漿體樣品中提取的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為：10×PCR buffer 5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，Taq DNA 聚合酶 0.3μL(5u)，上、下游引物 (50pmol/μL)各0.5μL，模板(10ng/μL)1μL。反應(yīng)條件：94℃3m in；94℃ 1min、57.6℃ 1m in、72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察并分析結(jié)果。

1.7 PCR敏感性試驗(yàn) 將PKo，B31和PBi3株代表性B.burgdorferi基因組DNA進(jìn)行分光光度計(jì)測定含量，稀釋至 10ng/μL，10倍倍比稀釋(10-1～10-12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測其敏感性。

1.8 流行病學(xué)調(diào)查 以提取的667只蜱樣品基因組DNA為模板，用SL1引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物篩選及PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果 分別對3對引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件進(jìn)行比較，從中篩選出特異性和敏感性較好的一組引物SL1，退火溫度確定為57.6℃。對14株B.burgdorferi分離株的OspA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均出現(xiàn)了與預(yù)期片段大小一致的條帶，大小約為 300bp(圖 1)。擴(kuò)增產(chǎn)物測序及BLAST分析結(jié)果表明，其序列為B.burgdorferi OspA基因，而衣原體、支原體、牛無漿體、羊無漿體和牛羊血液基因組DNA及陰性對照，均無擴(kuò)增片段。結(jié)果表明，所建立的PCR方法具有良好的特異性。OspA是B.burgdorferi主要外膜蛋白之一，在體外和體內(nèi)高效表達(dá)。OspA是一種粘附素(Adhesion)，對螺旋體在蜱腸中(M idgut)的定居至關(guān)重要，缺乏該蛋白B.burgdorferi在蜱體內(nèi)無法存活。B.burgdorferi OspA與其他微生物如梅毒螺旋體、赫氏疏螺旋體和鉤端螺旋體的交叉反應(yīng)較低，因此，在分子診斷及流行病學(xué)研究方面有重要意義[9]。

2.2 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果 選用B.burgdorferi 3個(gè)致病性種代表株，將基因組DNA定量后，稀釋為 10ng/μL，以 10倍倍比稀釋進(jìn)行 PCR檢測。BB、BG和BA 3種基因組DNA樣品的最低檢出量分別為0.01pg、1pg和10pg，即該方法可檢測到0.01pg～10pg的基因組DNA(圖2)，表明該方法具有較高的敏感性。

2.3 野外樣品檢測結(jié)果 對采集自7個(gè)省份的蜱用建立的PCR方法進(jìn)行檢測，其中革蜱屬10只為陽性，血蜱屬有11只檢測為陽性，牛蜱屬59只為陽性，扇頭蜱屬14只為陽性結(jié)果，4種蜱屬的檢出率分別為 4%(10/264)，6%(11/137)，32%(59/185)和31%(14/45)。

這4種蜱屬中的3種，即：牛蜱屬，血蜱屬和革蜱屬，體內(nèi)存在萊姆病病原，并且?guī)Ь瘦^高，表明這些蜱可能在萊姆病的流行與傳播中發(fā)揮一定的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，湖南省和廣西省的牛蜱屬感染率較高，與以往報(bào)道結(jié)果相符，證實(shí)牛蜱在這些地區(qū)為萊姆病傳播的優(yōu)勢蜱屬[10]，而血蜱屬感染率與以往所報(bào)道的相比較低，這可能與采集地區(qū)蜱的分布及萊姆病流行地區(qū)的密度有關(guān)。從甘肅省采集的蜱體內(nèi)分離到B.burgdorferi病原也已得到證實(shí)[11]。本研究首次從黑龍江尚志市采集的革蜱體內(nèi)檢測到B.burgdorferi，而吉林省琿春市革蜱的檢測結(jié)果比黃海楠等報(bào)道的用RFLP法檢測的革蜱的感染率低[12]，造成這種差異的原因可能與采集地地理區(qū)域的差異、檢測樣本的數(shù)量和該蜱本身的自然感染率的高低有關(guān)。扇頭蜱在萊姆病傳播中的媒介作用目前未見報(bào)道，本研究首次從扇頭蜱體內(nèi)檢測到B.burgdorferi，并認(rèn)為可能該蜱屬是萊姆病潛在的傳播媒介，其媒介地位需進(jìn)一步證實(shí)。我國蜱的種類較多,已證實(shí)有30種蜱具有醫(yī)學(xué)重要性，對人畜的攻擊性強(qiáng)，作為萊姆病媒介的可能性較大，并且存在著較大的地區(qū)差異。研究證實(shí)在我國北方林區(qū)全溝硬蜱為優(yōu)勢種，河南、山東等地長角血蜱為優(yōu)勢種，南方林區(qū)為二棘血蜱和粒形硬蜱傳播本病[13-14]。

本研究建立的PCR方法具有較高的特異性和敏感性。對來自于牛羊體表的蜱體內(nèi)B.burgdorferi感染情況的調(diào)查結(jié)果表明，該方法適應(yīng)于評估B.burgdorferi在這些地區(qū)的感染狀況，確定其對人畜可能造成感染的潛在威脅的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，從而有助于控制萊姆病的傳播與流行，減少經(jīng)濟(jì)損失，為我國萊姆病的防治提供診斷方法。

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