張艷，范俊安，夏永鵬，邱宗蔭，李隆云，王賓豪（.重慶市中藥研究院重慶市中藥良種選育與評價工程技術(shù)研究中心，重慶市 400065；.重慶市食品藥品監(jiān)督管理局，重慶市 40004；.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶市 40006）

牡丹皮又稱丹皮，為毛莨科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的根皮[1]。重慶墊江縣種植牡丹皮歷史悠久[2]，是全國三大牡丹皮主產(chǎn)地之一。在秋季采挖牡丹根刮去表皮抽去木心曬干為刮丹皮，只抽去木心不刮表皮直接曬干為原丹皮。目前，牡丹皮質(zhì)量分析與控制的主流指標(biāo)是丹皮酚含量測定[3]。筆者對重慶墊江牡丹皮進行了系統(tǒng)的質(zhì)量分析[4]，本文著重報告對刮丹皮的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究結(jié)果。

1 材料

1.1 儀器與試藥

2695-2996型HPLC儀，包括PDA檢測器等（美國Waters公司）；ZX98-1型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器（上海有機化學(xué)研究所）；KQ-600型超聲清洗器（鞏義市英峪予華儀器廠）；植物粉碎機（北京鑫環(huán)亞科技有限公司）。丹皮酚、芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110708-200205、110736-200220）；提取用甲醇（分析純，重慶川東化工（集團）有限公司化學(xué)試劑廠）；HPLC流動相用甲醇（色譜純，美國默克公司）。

1.2 藥材

從重慶墊江縣牡丹皮種植基地采集主要栽培品種紅花牡丹植物標(biāo)本及刮丹皮樣品10批（材料見表1），采樣地點根據(jù)種植基地的實際分布情況[2]設(shè)計，采樣點的土壤、海拔及采收時間等根據(jù)墊江牡丹皮最適宜的種植條件設(shè)計并相對固定（有關(guān)墊江牡丹皮最適種植條件的研究另文[5]發(fā)表），以確保樣品具有代表性。樣品及原植物經(jīng)筆者鑒定為毛茛科芍藥屬植物牡丹P.suffruticosaAndr.。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

表1 墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜研究試驗材料Tab 1 Test materials used for the study of fingerprints of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

檢測及分析方法與重慶墊江原丹皮HPLC指紋圖譜研究方法相同[5，6]。

2.2 結(jié)果

共測定10批樣品，將所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)專用軟件進行匹配分析（以刮丹1.cdf為參考模板，10個樣品指紋圖譜匹配后自動生成1個對照指紋圖譜），得到共有峰12個。各色譜峰保留時間的RSD均＜1%，2個標(biāo)志性成分峰面積的RSD分別為芍藥苷21.52%、丹皮酚15.67%；以丹皮酚峰的峰面積為1計算各共有峰的相對峰面積即為各樣品色譜圖的指紋信息，樣品間各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.5%，芍藥苷相對峰面積的RSD＝22.26%。墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果見表2；共有峰數(shù)據(jù)見表3；匹配圖譜見圖1。

表2 墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果Tab 2 Similarities of the HPLC fingerprints of 10 Patches of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

表3 墊江刮丹皮10批樣品指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)Tab 3 Chromatographic data of common peaks in HPLC fingerprints of 10 Patches of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

除少數(shù)樣品之間的兩兩相似度小于但十分接近0.9外，其余各樣品之間的兩兩相似度均＞0.9。10批刮丹皮樣品的色譜峰出峰時間、順序、整體峰形基本一致，各樣品化學(xué)成分基本相同，質(zhì)量相似度高，相互差異較小，指紋圖譜共性特征明顯；同時也表明10批刮丹皮樣品具有很強的代表性，能夠代表墊江刮丹皮的質(zhì)量特征。生成的對照圖譜（圖中標(biāo)識為R）與所有樣品的相似度均＞0.9，而且除2個樣品外其余均＞0.95，表明生成的對照圖譜能夠代表墊江刮丹皮10批樣品的共同特征，可以作為墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

圖1 墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜匹配圖譜A.匹配前圖譜；B.匹配后圖譜Fig 1 Matched HPLC fingerprints of 10 batches of shavedP.suffruticosa cultivated in Dianjiang county A.Pre-matched fingerprints；B.matched fingerprints

各樣品指紋圖譜共有峰占總峰面積的比例為83.53%～96.28%，平均為90.61%，RSD＝5.32%，非共有峰面積占8.39%＜10%，表明匹配過程中特征峰提取較為充分，作為非共有峰省略的信息很少；相似度和共有峰面積比例均符合國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家藥典委員會關(guān)于中藥注射劑指紋圖譜研究的相關(guān)技術(shù)要求[7，8]，故匹配所得12個共有峰能夠充分表達墊江刮丹皮的質(zhì)量特征。其中，由于峰k的峰面積小，相對峰面積不到0.05，而且與10號峰時間間距很短，實際檢測應(yīng)用中峰k信息可并入10號峰。因此，將峰k之外的其它11個共有峰標(biāo)定為墊江刮丹皮的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜特征峰，并以出峰時間順序依次編號，其中4號峰為芍藥苷，11號峰為丹皮酚。墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜色譜數(shù)據(jù)見表4；標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜見圖2。

3 討論

以共有峰信息作為指紋圖譜能夠充分表達墊江刮丹皮的質(zhì)量特征；10批樣品共有峰面積的RSD和相對峰面積的RSD均較大，表明各樣品的化學(xué)成分存在量上的明顯差異，以單一成分的含量測定不能科學(xué)判斷藥材質(zhì)量；但單峰面積超過20%的色譜峰只有丹皮酚和芍藥苷峰，其它峰的單峰面積均未達到10%，而芍藥苷峰相對峰面積的RSD＝22%，明顯小于其它峰，表明芍藥苷含量相對穩(wěn)定。因此，建議在丹皮酚之外增加芍藥苷作為牡丹皮質(zhì)量控制的一個重要的定量指標(biāo)。

從安徽、河南、湖北、山東等產(chǎn)地收集刮丹皮樣品，另從重慶中藥材市場收集產(chǎn)地標(biāo)識為“重慶”的刮丹皮（樣品A），在相同色譜條件下檢測指紋圖譜，并與本文建立的墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進行對比分析。結(jié)果，各產(chǎn)地樣品與墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均＞0.9，但與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相匹配后，缺失了3號、5號和6號3個特征峰，總峰面積和共有峰面積均顯著減少；芍藥苷峰的相對峰面積均明顯低于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，表明墊江刮丹皮與安徽、河南、湖北、山東等產(chǎn)地的刮丹皮相似度高，但仍存在區(qū)別。樣品A具有墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的所有特征峰，且與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度達0.958；而與安徽、河南、湖北、山東各產(chǎn)地樣品間的相似度均＜0.9（各產(chǎn)地樣品間兩兩相似度均＞0.9），其中最小的與湖北刮丹皮的相似度僅為0.754；總峰面積、芍藥苷峰的相對峰面積與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜十分接近，表明樣品A與各產(chǎn)地樣品區(qū)別大而與重慶墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度高；結(jié)合樣品A外觀性狀與重慶墊江刮丹皮基本相同的情況，可以認(rèn)定樣品A就是重慶墊江產(chǎn)刮丹皮。這些試驗進一步證明了指紋圖譜可以作為牡丹皮質(zhì)量控制和產(chǎn)地鑒別的重要參考依據(jù)。

表4 墊江刮丹皮標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜色譜數(shù)據(jù)Tab 4 Chromatographic data of standard HPLC fingerprints of shaved P.suffruticosa cultivated in Dianjiang county

圖2 墊江刮丹皮HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜4.芍藥苷；11.丹皮酚（參照峰）Fig 2Standard HPLC fingerprints of shaved P.suffruticosa cultivated in Dianjiang county4.paeoniflorin；11.paeono（lreference peak）

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：119.

[2]范俊安，張 艷，夏永鵬，等.重慶墊江牡丹皮歷史考證與生產(chǎn)現(xiàn)狀分析[J].中藥材，2006，29（4）：401.

[3]范俊安，夏永鵬，申明亮，等.近15年牡丹皮研究文獻分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（6）：103.

[4]范俊安.重慶墊江牡丹皮質(zhì)量分析與控制研究[C].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2006：58～80.

[5]范俊安，夏永鵬，邱宗蔭，等.重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅰ）——不同因素的影響及牡丹皮最適宜種植條件選擇[J].中國藥房，2009，20（21）：1 667.

[6]張 艷，范俊安，夏永鵬，等.重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅱ）——原丹皮指紋圖譜[J].中國藥房，2009，20（33）：2 602.

[7]國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》的通知[Z].國藥管注[2000]348號，2000-08-15.

[8]國家藥典委員會.關(guān)于印發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南》的通知[Z].2002-04-27.