顧佳萍，袁濤

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

赤潮毒素軟骨藻酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展

顧佳萍，袁濤

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

海洋環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，赤潮的頻發(fā)導(dǎo)致赤潮藻毒素嚴(yán)重威脅著人類健康。軟骨藻酸是由擬菱形藻產(chǎn)生的一種記憶喪失性貝類毒素，在很多海域均有檢出和中毒報(bào)道。針對(duì)中國(guó)相關(guān)研究較為薄弱的現(xiàn)狀，本文首先介紹軟骨藻酸的研究背景、理化性質(zhì)和毒性，然后對(duì)其檢測(cè)分析方法進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，討論了生物分析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、毛細(xì)管電泳法等各自的優(yōu)缺點(diǎn)及適用性，并建議今后要結(jié)合分子模擬技術(shù)、分子印跡技術(shù)、膠體金、生物傳感器等技術(shù)研發(fā)更快速、簡(jiǎn)便、靈敏的新方法。

赤潮藻毒素；記憶喪失性貝毒；軟骨藻酸；檢測(cè)；進(jìn)展

Abstract：Marine pollution becomes worse in recent years and frequently occurred red tides is threatening human health due to the marine algal toxins.Domoic Acid (DA),an amnesic shellfish toxin mainly produced by Pseudo-nitzschia,has been identified and reported with poisoning cases in many sea areas.As the relevant researches are limited in China,this paper firstly introduced the research background,physical-chemical properties and toxicity of DA.The analytical methods were then reviewed in detail.The pros and cons of the methods,such as bioassay,high-performance liquid chromatography,enzyme-linked immunoassay,capillary electrophoresis,were discussed.Finally,some promising directions were proposed to develop faster,simpler and more sensitive detection methods for DA based on several new developed technologies such as molecular simulation,molecular imprinting,colloidal gold,biosensor and so on.This paper provides some important information for the DA relevant researches.

Keywords：marine algal toxin; amnesic shellfish poisoning; domoic acid; detection; development

近三十年來，海洋環(huán)境污染日趨加重，海洋赤潮也頻頻發(fā)生。由赤潮生物產(chǎn)生的大量生物毒素通過食物鏈污染了水生動(dòng)物，進(jìn)而威脅人類健康。軟骨藻酸（Domoic Acid,DA）是一種記憶喪失性貝類毒素，它最早是在 1987年加拿大愛德華王子島的東海岸因食用紫貽貝而造成的食物中毒事件中被發(fā)現(xiàn)的。中毒者癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、嘔吐，并伴有記憶喪失、意識(shí)混亂、不能辨認(rèn)家人及親朋好友等嚴(yán)重精神癥狀，嚴(yán)重者陷于昏睡狀態(tài)甚至死亡，中毒者即使在病愈后仍然喪失記憶長(zhǎng)達(dá)十幾個(gè)月，因此稱之為記憶喪失性貝類中毒。后來經(jīng)過專家們分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該中毒物質(zhì)為 DA，主要由經(jīng)常在加拿大東海岸形成赤潮的一種硅藻——多列擬菱形藻產(chǎn)生[1]。此后，在加拿大、美國(guó)海岸，擬菱形藻赤潮產(chǎn)生 DA而引起危害的事件不斷被報(bào)道。

由于貝類毒素毒性大，反應(yīng)快，無適宜解毒劑，給防治帶來了許多困難，因此開展貝類毒素的快速檢測(cè)研究對(duì)確保水產(chǎn)品安全及人體健康極為重要。目前國(guó)外對(duì)DA的研究主要集中于水產(chǎn)品中含量的檢測(cè)方法以及毒性研究，但中國(guó)對(duì)其研究還屬于起步階段，尚缺乏有效的檢測(cè)手段和監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)。

中國(guó)是一個(gè)貝類生產(chǎn)大國(guó)，近幾年來的赤潮藻類污染對(duì)貝類的影響越來越大，貝毒不僅對(duì)人類的健康構(gòu)成威脅，而且影響了貝類的銷售，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立快速、高效、特異、靈敏的貝毒素檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。雖然中國(guó)檢出DA的報(bào)導(dǎo)還很罕見，但在中國(guó)海區(qū)，已經(jīng)檢測(cè)到了多種擬菱形藻，其廣泛分布在中國(guó)沿海，其中有九種擬菱形藻是潛在產(chǎn)毒種，在非中國(guó)海區(qū)均有產(chǎn)毒報(bào)道[2]。中國(guó)現(xiàn)在幾乎沒有檢出DA有可能是因?yàn)槟壳爸袊?guó)擬菱形藻污染還不嚴(yán)重，但也有可能是現(xiàn)有的檢測(cè)方法還不夠靈敏，缺乏有效的檢測(cè)技術(shù)。本文綜述了國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，詳細(xì)分析了各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并討論了今后研究的新思路，為中國(guó)盡快建立高效的檢測(cè)痕量DA的方法提供重要參考。

1 軟骨藻酸理化性質(zhì)和毒性

DA分子式為C15H21NO6，分子量為311.33，其分子結(jié)構(gòu)如圖 1。DA純品為白色固體粉末，溶于水，微溶于甲醇，熔點(diǎn)223～224 ℃，在紫外光譜區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為242 nm，在體積比為1:9的乙腈/水溶液和-12 ℃黑暗條件下可保持穩(wěn)定一年左右[3]。DA在常溫或光照下在堿性溶液中不會(huì)降解[4]，但它在酸性溶液(pH =3)中一星期降解50%[5]。DA分子中含有三個(gè)羧基和一個(gè)仲氨基，羧基結(jié)構(gòu)的pKa分別為 2.10、3.72、4.97，氨基結(jié)構(gòu)的 pKa為 9.82[6]，因此它在溶液中的存在受pH的影響[7]。

圖1 軟骨藻酸分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of DA

DA是一種興奮性脯氨酸衍生物和神經(jīng)毒素，是浮游植物代謝的產(chǎn)物，可以在被藻類污染的海洋食物特別是貝類中檢測(cè)到，其結(jié)構(gòu)與紅藻氨酸和谷氨酸相似，是紅藻氨酸受體的興奮劑[3,8]。DA主要由某些擬菱形藻屬和菱形藻屬的海洋硅藻產(chǎn)生，Walz等[9]檢測(cè)了水中澳洲擬菱形藻的含量及DA的濃度，只要該種藻在水中的含量達(dá) 4.0×103個(gè)/L，就可檢出DA。

水生動(dòng)物(尤其是貝類)能富集DA，但同時(shí)它們具有很強(qiáng)的耐受力，而食用這些水生動(dòng)物的鳥類、海洋哺乳類動(dòng)物和人類則會(huì)引起不同程度的中毒癥狀。貝殼類動(dòng)物的攝食過程是通過不斷過濾水流進(jìn)行的，這樣在它們的內(nèi)臟組織中會(huì)濃縮蓄積DA，并在組織間遷移，可通過食物鏈影響人類健康。DA可以通過胃腸粘膜吸收，但吸收率低[10]，其純品也可通過呼吸道、角膜和皮膚直接進(jìn)入體內(nèi)而產(chǎn)生危害。在血液中，DA以帶電的親水分子形式存在，能夠到達(dá)所有外周組織[11]。

DA可影響人和動(dòng)物的消化道、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[12]，它對(duì)與內(nèi)臟功能有關(guān)的腦干區(qū)域具有興奮作用，而對(duì)與記憶有關(guān)的腦區(qū)域具有明顯的神經(jīng)毒性作用。此外，DA也會(huì)損害脊髓、視網(wǎng)膜[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，貝組織中DA含量達(dá)到40 mg/kg時(shí)可引起食用者中毒，150 mg/kg時(shí)有致死危險(xiǎn)，人類通過進(jìn)食可耐受的最大限量為20 mg/kg，加拿大首先制定了DA的安全限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/g貝肉，歐洲、日本也相繼將該種毒素列為貝類常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)

目[7,14,15]。

2 軟骨藻酸檢測(cè)分析方法

DA的檢測(cè)方法有好幾種，主要檢測(cè)的是貝類、浮游植物、海水以及人體和動(dòng)物血液、尿液、糞便中DA的含量。常用的檢測(cè)方法主要有生物分析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、毛細(xì)管電泳法等等。生物分析法靈敏度較低，選擇性弱，因此應(yīng)用有限。高效液相色譜法是目前官方指定的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法檢測(cè)限低，靈敏度高，特異性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。高效液相色譜的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器，由于貝類提取液中干擾組分復(fù)雜，光度檢測(cè)往往不能提供化合物的充分結(jié)構(gòu)信息，因此會(huì)引起假陽性的結(jié)果，而質(zhì)譜能提供化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，是一種高效的方法，能作為 DA確證的分析方法。另外，在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，近年來發(fā)展了許多新的檢測(cè)方法，如神經(jīng)受體結(jié)合檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器法等，但目前應(yīng)用范圍不廣，還存在一些缺陷，沒有被廣泛采用。

2.1 生物分析法

小鼠生物分析法是最早用于DA檢測(cè)的一種經(jīng)典方法，其原理是將毒素注射入小白鼠體內(nèi)，根據(jù)注射后小鼠的存活時(shí)間和中毒癥狀來評(píng)價(jià)毒性，一般用半致死劑量表示[16]。1987年該方法首次應(yīng)用于加拿大DA中毒事件中DA的測(cè)定，結(jié)果顯示該方法適于檢測(cè)貝類組織中高濃度的DA(高于30 μg/g)，DA濃度較低時(shí)無法檢測(cè)(低于20 μg/g)[17]。該方法具有應(yīng)用廣泛、有歷史數(shù)據(jù)、能表達(dá)出樣品實(shí)際毒性、不需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在著許多缺陷和不足，如靈敏度低、假陽性高、重現(xiàn)性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、無法區(qū)別毒素的種類等[17]，已逐漸被其他新的分析方法所取代。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法是目前檢測(cè)DA應(yīng)用最廣的方法，已被多國(guó)列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[18]中規(guī)定使用反相高效液相色譜法檢測(cè)海產(chǎn)雙殼類貝肉、貝柱、外套膜及其制品(不包括鹽漬制品)中的DA含量，該方法檢測(cè)限為1 μg。

生物分析法注重的是樣品毒性的分析，其專一性和靈敏度低，而高效液相色譜法則能靈敏、快速、準(zhǔn)確地確定各種毒素成分，被廣泛用于研究和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。HPLC檢測(cè)DA是利用其在242 nm處具有最大吸收值的特征使用紫外或二極管檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，或者將 DA衍生后通過熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析，或使用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。其中質(zhì)譜法檢測(cè)范圍廣、靈敏度高、定性準(zhǔn)確、速度快、操作簡(jiǎn)單，已被越來越多的研究人員采用。

2.2.1 紫外檢測(cè)法 高效液相色譜－紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）特別適用于貝類組織中DA含量的測(cè)定，尤其適用于毒素含量超過20 μg/g的情況。Lawrence等人建立[19]以及 Quilliam 等[20]改進(jìn)的HPLC-UV法采用了反相C18柱在242 nm處檢測(cè)DA，該方法已被英國(guó)、愛爾蘭等國(guó)定為標(biāo)準(zhǔn)方法[21]。后來，又有一些研究人員對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)。López-Rivera等[22]建立了一種不需要固相萃取預(yù)處理檢測(cè)DA的HPLC-UV法，通過等梯度淋洗以及控制流動(dòng)相pH來分離化合物，結(jié)果表明，最佳pH為2.5，方法檢測(cè)限為25 ng/mL。該方法快速、靈敏，能成功檢測(cè)大批量貝類樣品。HPLC-UV法已經(jīng)被很多研究人員用來檢測(cè)貝類等動(dòng)物組織中的DA含量。Costa等[23]用HPLC-UV法檢測(cè)了葡萄牙海岸的兩種章魚E.cirrhosa和 E.moschata體內(nèi)DA的含量，結(jié)果表明，DA含量超過了100 μg/g，其中，E.moschata體內(nèi)毒素含量更高，表明DA可能通過食物鏈由這種章魚體內(nèi)進(jìn)入更高級(jí)消費(fèi)者如人類體內(nèi)，潛在危險(xiǎn)性更大。中國(guó)對(duì)DA的檢測(cè)大多采用HPLC-UV法，陳西平等[24]采用該方法檢測(cè)了部分水及水生動(dòng)物中DA的含量。結(jié)果表明，雖然在海水及地面淡水中未檢出 DA，但部分海洋貝殼動(dòng)物體內(nèi)有檢出。因此，隨著海洋污染的加劇，現(xiàn)階段中國(guó)的DA污染問題不容忽視，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其污染狀況的監(jiān)測(cè)。

2.2.2 熒光檢測(cè)法 高效液相色譜－熒光檢測(cè)法是使用衍生劑將 DA 衍生成含熒光基團(tuán)的物質(zhì)，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，在DA分子上引入熒光基團(tuán)可使方法的靈敏度提高。James等[25]使用NBD-F來衍生化 DA，用等梯度淋洗程序分離化合物，激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，方法檢測(cè)限高于1 ng/mL，貝類組織中DA的回收率＞95%，當(dāng)用強(qiáng)陰離子交換SPE柱萃取DA時(shí)，檢測(cè)限達(dá)到6 ngDA/g貝類組織。Chan等[26]參考了這種方法來檢測(cè)DA，但他們改進(jìn)了樣品預(yù)處理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，并探討了最佳pH，結(jié)果表明，吸附的最佳pH為4，解吸時(shí)pH則為11，吸附平衡時(shí)間為2小時(shí)，最佳吸附劑裝載量為0.67 mgTiO2/ngDA。最近，Maroulis等[27]采用NBD-Cl柱后衍生DA進(jìn)行檢測(cè)，成功測(cè)得了貝類組織中DA含量為75 μg/kg的樣品，該方法檢測(cè)限低至25 ppb，能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化分析，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，干擾少。由于大多數(shù)衍生試劑價(jià)格昂貴、不穩(wěn)定，且其分解產(chǎn)物可能出現(xiàn)在色譜圖中，同時(shí)衍生試劑的變質(zhì)也可能導(dǎo)致毒素的不完全衍生化，因此熒光檢測(cè)法的實(shí)際應(yīng)用很少。

2.2.3 質(zhì)譜法 現(xiàn)今，由于質(zhì)譜技術(shù)具有檢測(cè)范圍廣、靈敏度高、速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為 DA檢測(cè)的常用手段。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)可以不使用衍生試劑和毒素標(biāo)準(zhǔn)品，相比其他檢測(cè)器，具有很大的優(yōu)勢(shì)。然而本方法對(duì)設(shè)備條件要求較高，現(xiàn)階段還不能大量用于基層的日常監(jiān)測(cè)工作。Lawrence等[28]建立的高效液相色譜－電噴霧離子阱質(zhì)譜法(HPLC/ESI-MS)法是一種高靈敏度、高選擇性的方法，被應(yīng)用到了環(huán)境中各種介質(zhì)的檢測(cè)中，并被后人不斷改進(jìn)，但是這種方法對(duì)樣品預(yù)處理的要求較高。宋琍琍等[29]參考了這種方法來測(cè)定DA殘留。樣品經(jīng)50%甲醇提取，LC-SAX柱凈化，然后選用電噴霧離子源進(jìn)行測(cè)定分析，該方法的定量限為 0.02 μg/g。Pardo等[30]采用加壓濕法萃取(PLE)來提取DA，然后用液相色譜-電噴霧電離雙質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS-MS)法來檢測(cè)DA，電離源采用電噴霧可以提高分析信號(hào)，方法經(jīng)過優(yōu)化后回收率在81%至95%之間，他們用此方法成功檢測(cè)了46個(gè)西班牙超市里的貝類樣品，表明該方法能進(jìn)行大批量檢測(cè)。Wang等[31]采用LC-MS對(duì)水樣和浮游植物中的DA進(jìn)行了定性和定量分析，樣品預(yù)處理采用C18柱進(jìn)行固相萃取，結(jié)果表明，酸性條件有利于在C18柱上保留親水性的DA，加標(biāo)水樣的回收率超過了 90%，浮游植物樣品的回收率則接近98%，方法檢測(cè)限為0.03 ng/mL，本方法不僅可以證明DA是由浮游植物產(chǎn)生的，還揭示了溶解在水中的DA也有可能進(jìn)入海洋食物鏈網(wǎng)。Iglesia等[32]也采用LC-MS法檢測(cè)了海水中的DA及它的異構(gòu)體，但樣品預(yù)處理采用的是固相萃取盤，該方法的檢測(cè)限為 0.02 ng/mL，回收率為92.1%～110.6%，用此方法能檢測(cè)海水中的痕量DA。

2.3 酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析法[33]，即根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)，采用特異性貝類毒素的抗體來檢測(cè) DA。免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法、熒光免疫法等，具有方便、快速的特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是費(fèi)用較高，而且各毒素之間的交叉反應(yīng)低，不能全面體現(xiàn)出樣品的毒性。檢測(cè)DA所采用的免疫分析方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。

ELISA是利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過酶作用于底物后的顯色反應(yīng)判定結(jié)果，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，由于其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用目測(cè)，也可用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的雙重優(yōu)點(diǎn)[33]。

Yu等[34]采用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和小牛血清蛋白(BSA)為載體，進(jìn)行直接酶聯(lián)免疫測(cè)定，結(jié)果表明，藍(lán)貽貝樣品的檢測(cè)限＜25 ng/g，回收率為81.1%，Yu等還將實(shí)驗(yàn)結(jié)果用HPLC方法進(jìn)行了驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)15種被污染的貝類樣品中有10種樣品的DA含量＜50 ng/g。

Maucher等[35]結(jié)合ELISA技術(shù)使用血液采集卡來提取小鼠血液中的 DA，這種方法可以避免 DA在血液中被清除。一般說來，在4小時(shí)內(nèi)，99%的DA會(huì)從血液中被清除，但使用該方法后，DA在24小時(shí)內(nèi)仍然能被檢測(cè)到。該方法靈敏度高，用血液采集卡提取樣品方便，因此可用此方法來監(jiān)測(cè)海洋哺乳動(dòng)物體內(nèi)的DA含量。

Tsao等[36]采用單克隆抗體 ELISA檢測(cè)法檢測(cè)DA，并建立了基于單克隆抗體的膠體金免疫條檢測(cè)法，免疫條檢測(cè)法的檢測(cè)限為5 ng/mL，在十分鐘內(nèi)就可完成檢測(cè)。Tsao等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用免疫條檢測(cè)得到的結(jié)果與用 ELISA方法得到的結(jié)果有很好的吻合性，可以用來快速檢測(cè)貝類樣品中的DA。

另外，Shaw等[37]建立了基于基因工程單鏈抗體（scFv）競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，相比傳統(tǒng)方法，這種方法具有很多優(yōu)勢(shì)，基因工程單鏈抗體（scFv）可以在大腸桿菌中快速、大量地得到表達(dá)，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于檢測(cè)或其它用途。用該方法檢測(cè)天然扇貝組織得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法檢測(cè)的結(jié)果基本相符。

大多數(shù)ELISA法采用的都是直接法，而許道艷等[38]則以 DA-OVA 為包被抗原，利用抗原抗體反應(yīng)，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)分析檢測(cè)海水樣品和海洋貝類中DA的方法。結(jié)果表明，該方法最低檢出限為 10 μg/L，海水樣品平均回收率為102.2%，貝類樣品平均回收率為111.5%。

ELISA方法能夠進(jìn)行批量檢測(cè)，但特異性較差，因而主要用于DA的初步篩選。另外，由于DA標(biāo)準(zhǔn)品昂貴，且DA分子量太小，因此制備免疫抗原較困難，從而限制了免疫方法在DA分析中的應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)還未見商品化的免疫檢測(cè)試劑盒。

2.4 毛細(xì)管電泳法（CE）

毛細(xì)管電泳法的基本原理是不同荷質(zhì)比的帶電粒子在電場(chǎng)中具有不同的遷移速度而得到分離，然后再經(jīng)過熒光或紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[17]。該方法具有操作簡(jiǎn)單、分離速度快、靈敏度高、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，是貝類等生物體內(nèi)DA含量常規(guī)檢測(cè)較理想的方法。

Zhao等[39]建立了毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法來檢測(cè)海洋食物中的DA，首先用SPE提純，使用了強(qiáng)陰離子交換柱和強(qiáng)陽離子交換柱，避免了基體中色氨酸的干擾，然后用CE-UV在242 nm處檢測(cè)，該方法能用于檢測(cè)貽貝、縊蟶、鳳尾魚等樣品，最低能檢出150 ng/g DA。但是在實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電泳法的靈敏度要比液相色譜法(檢測(cè)限 20 ng/g)低。李大志等[40]也采用這種方法對(duì)2001年5月在大連海域(黑石礁海區(qū))采集的 5種貝類進(jìn)行分析，結(jié)果表明大連海域黑石礁海區(qū)的扇貝受到了DA的污染。Kvasni?ka等[41]則建立了一種在線毛細(xì)管等速電泳-毛細(xì)管區(qū)帶電泳法來檢測(cè)貝類和藻類中的DA。該方法優(yōu)化了電解液系統(tǒng)，使DA能在25分鐘內(nèi)從甲醇提取液中分離出來，檢測(cè)限為1.5 μg/L。

2.5 其他分析方法

除了高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等較常用的方法外，其他方法如薄層色譜法、神經(jīng)受體結(jié)合檢測(cè)法、生物傳感器法等也被嘗試用于檢測(cè)DA。

薄層色譜法（TLC）是將固定相涂布在平板上，點(diǎn)樣后用合適的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，不同組分的毒素將在平板上分開。該方法快速、簡(jiǎn)單，不需要使用復(fù)雜的儀器，對(duì)貝組織中 DA的檢出限約為10 μg/g[42]。由于其檢出限過高、無法準(zhǔn)確定量，因此到目前未被廣泛推廣使用。

Van Dolah等人建立了競(jìng)爭(zhēng)性神經(jīng)受體分析測(cè)試DA毒素的方法，該方法非常靈敏，具有高度專一性[43]，目前已用來分析貝類和藻類的提取物[44]。其原理主要是使用青蛙的腦突觸體作為受體，將紅藻氨酸放射標(biāo)記的 DA 結(jié)合在谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)上，觀察神經(jīng)細(xì)胞流的情況。放射受體分析法測(cè)試毒素的檢測(cè)靈敏度非常高，但由于實(shí)驗(yàn)中使用了放射同位素，限制了這一方法的推廣使用。

生物傳感器是一種快捷、低廉的檢測(cè)技術(shù)，其原理是待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入生物活性材料，經(jīng)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的物理或化學(xué)換能器轉(zhuǎn)變成可定量處理的電信號(hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，便可知道待測(cè)物濃度。Stevens等[45]建立了一個(gè)表面等離子體共振生物傳感器系統(tǒng)，可以檢測(cè)貝類、藻類以及海水中4～60 ppb的DA。Lotierzo等[46]則采用了分子印跡聚合物作為傳感器來檢測(cè) DA，該傳感器與單克隆抗體相比，分子印跡聚合物芯片再生時(shí)，其識(shí)別性能不會(huì)受到影響且能夠連續(xù)測(cè)量至少2個(gè)月。

3 結(jié)論與展望

目前國(guó)內(nèi)外所采用的 DA 的檢測(cè)方法都有進(jìn)一步完善的必要，例如，對(duì)于免疫分析法，未來的發(fā)展方向是制作快速檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速、簡(jiǎn)便分析。雖然現(xiàn)在已經(jīng)制作出DA的免疫檢測(cè)試劑盒，但還有著改進(jìn)空間，如果能夠結(jié)合分子印跡技術(shù)、膠體金、生物傳感器等新方法，可以使DA的檢測(cè)更簡(jiǎn)便、更快速、更準(zhǔn)確。

高效液相色譜－質(zhì)譜法是目前應(yīng)用較廣的方法，有極好的發(fā)展前景，但其對(duì)樣品預(yù)處理要求較高，因此想要提高該方法的檢測(cè)效果，應(yīng)該從樣品預(yù)處理方法上進(jìn)行突破，提高進(jìn)樣溶液的純度。一般樣品預(yù)處理采用的是固相萃取法，除了改進(jìn)固相萃取的各種條件外，尋找能更好吸附DA的固相萃取填充材料也極為重要?？梢試L試采用分子模擬技術(shù)來篩選填充材料。例如，利用分子模擬技術(shù)，通過電腦軟件計(jì)算分子間作用力來預(yù)測(cè)材料對(duì)DA分子的吸附效果，可以不通過實(shí)驗(yàn)就篩選出分子材料，這樣不僅可以節(jié)省大量的時(shí)間、精力，而且有望取得一些創(chuàng)新性成果，是未來選取固相萃取材料極具潛力的一種手段。

全球海洋環(huán)境不斷惡化，赤潮頻繁爆發(fā)，海水中DA的污染水平很可能會(huì)隨之加劇，但中國(guó)在這方面的研究還比較少，痕量DA的檢測(cè)方法還不完善，尤其是針對(duì)海水中DA的檢測(cè)研究非常少，因此迫切需要研究快速、簡(jiǎn)便、靈敏地檢測(cè)海水中DA的方法，盡快掌握該類藻毒素的信息，及時(shí)采取有效手段防止危害發(fā)生，保障人類健康。

[1]Wright J L C.Domoic acid - ten years after [J].Natural Toxins,1999,6(3-4): 91-92.

[2]邢小麗,楊軍霞,康燕玉,等.大亞灣水域兩種擬菱形藻的形態(tài)學(xué)鑒定及毒素分析 [J].臺(tái)灣海峽,2007,26(4): 576-582.

[3]劉偉斌,杜琦.國(guó)外軟骨藻酸的研究概況 [J].海洋湖沼通報(bào),1997(1): 67-70.

[4]Johannessen J N.Stability of domoic acid in saline dosing solutions[J].Journal of AOAC International,2000,83: 411-412.

[5]Quilliam M A,Sim P G,McCulloch A W,et al.High-performance liquid chromatography of domoic acid,a marine neurotoxin,with application to shellfish and plankton [J].International Journal of Environmental Analytical Chemistry,1989,36: 139-154.

[6]Pineiro N,Leao J M,Martinez A G,et al.Capilliary electrophoresis with diode array as an alternative analytical method for paralytic and amnesic shellfish toxins [J].Journal of Chromatography A,1999,847: 223-232.

[7]Jeffery B,Barlow T,Moizer K,et al.Amnesic shellfish poison [J].Food and Chemical Toxicology,2004,42(4): 545-557.

[8]Wright J L C,Boyd R K,De Freitas A S W,et al.Identification of domoic acid,a neuroexcitatory amino acid,in toxic mussels from eastern Prince Edward Island [J].Canadian Journal of Chemistry,1989,67: 481-490.

[9]Walz P M,Garrison D L,Graham W M,et al.Domoic acid-producing diatom blooms in Monterey Bay,California: 1991-1993 [J].Natural Toxins,1994,2(5): 271-279.

[10]Iverson F,Truelove J,Tryphonas L,et al.The toxicology of domoic acid administered systemically to rodents and primates [J].Canada Diseases Weekly Report,1990,16: 15-19.

[11]Preston E,Hynie I.Transfer constants for blood-brain barrier permeation of the neuroexcitatory shellfish toxin,domoic acid [J].Canadian journal of neurological sciences,1991,18: 39-44.

[12]Pulido O M.Domoic acid toxicologic pathology: A review [J].Marine Drugs 2008,6: 180-219.

[13]陳西平,劉江.水生態(tài)環(huán)境中神經(jīng)毒性生物毒素——軟骨藻酸[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2001,8(2): 92-95.

[14]Rue E,Bruland K.Domoic acid binds iron and copper: a possible role for the toxin produced by the marine diatom Pseudo-nitzschia[J].Marine Chemistry,2001,76: 127-134.

[15]王萍亞,趙華,陳皚,等.水產(chǎn)品中赤潮毒素殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,27(2): 144-450.

[16]杜偉,陸斗定.有毒赤潮藻及其毒素的危害與檢測(cè) [J].海洋學(xué)研究,2008,26(2): 89-97.

[17]吳多加,李鳳琴.軟骨藻酸與人類健康關(guān)系研究進(jìn)展 [J].衛(wèi)生研究,2005,34(3): 378-381.

[18]GB/T 5009.198-2003.貝類記憶喪失性貝類毒素軟骨藻酸的測(cè)定[S].遼寧: 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,2003.

[19]Lawrence J F,Ménard C.Determination of marine toxins by liquid chromatography [J].Fresenius' Journal of Analytical Chemistry,1991,339: 494-498.

[20]Quilliam M A,Xie M,Hardstaff W R.Rapid extraction and cleanup for liquid chromatographic determination of domoic acid in unsalted seafood [J].Journal of AOAC International,1995,78: 543-554.

[21]Hess P,McGovern E,McMahon T,et al.LC-UV and LC-MS methods for the determination of domoic acid [J].TrAC Trends in Analytical Chemistry,2005,24(4): 358-367.

[22]López-Rivera A,Suárez-Isla B A,Eilers P P,et al.Improved high-performance liquid chromatographic method for the determination of domoic acid and analogues in shellfish: effect of pH [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2005,381(8):1540-1545.

[23]Costa P R,Rosa R,Pereira J,et al.Detection of domoic acid,the amnesic shellfish toxin,in the digestive gland of Eledone cirrhosa and E.moschata (Cephalopoda,Octopoda)from the Portuguese coast [J].Aquatic Living Resources,2005,18: 395-400.

[24]陳西平,王成斌,胡俊明,等.HPLC方法檢測(cè)水及水生動(dòng)物中軟骨藻酸 [J].衛(wèi)生研究,2001,30(4): 247-248.

[25]James K J,Gillman M,Lehane M,et al.New fluorimetric method of liquid chromatography for the determination of the neurotoxin domoic acid in seafood and marine phytoplankton [J].Journal of Chromatography A,2000,871(1-2): 1-6.

[26]Chan I O M,Tsang V W H,Chu K K,et al.Solid-phase extraction-fluorimetric high performance liquid chromatographic determination of domoic acid in natural seawater mediated by an amorphous titania sorbent [J].Analytica Chimica Actam,2007,583(1): 111-117.

[27]Maroulis M,Monemvasios I,Vardaka E,et al.Determination of domoic acid in mussels by HPLC with post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl)and fluorescence detection [J].Journal of Chromatography B,2008,876(2): 245-251.

[28]Lawrence J F,Lau VP-Y,Cleroux C,et al.Comparison of UV absorption and electrospray mass-spectrometry for the high-performance liquid chromatographic determination of domoic acid in shellfish and biological samples [J].Journal of Chromatography A,1994,659: 119-126.

[29]宋琍琍,張海琪,侯鏡德,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定貝類毒素軟骨藻酸的殘留 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2008,32(6): 950-956.

[30]Pardo O,Yusà V,León N,et al.Development of a pressurised liquid extraction and liquid chromatography with electrospray ionization-tandem mass spectrometry method for the determination of domoic acid in shellfish [J].Journal of Chromatography A,2007,1154 (1-2): 287-294.

[31]Wang Z H,King K L,Ramsdell J S,et al.Determination of domoic acid in seawater and phytoplankton by liquid chromatography–tandem mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A,2007,1163(1-2): 169-176.

[32]Iglesia P,Giménez G,Diogène J.Determination of dissolved domoic acid in seawater with reversed-phase extraction disks and rapid resolution liquid chromatography tandem mass spectrometry with head-column trapping [J].Journal of Chromatography A,2008,1215(1-2): 116-124.

[33]汪世華,張峰,袁軍.生物毒素檢測(cè)技術(shù)新進(jìn)展 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2008,14 (5): 726-731.

[34]Yu F Y,Liu B H,Wu T S,et al.Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of domoic acid in shellfish [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52 (17): 5 334-5 339.

[35]Maucher J M,Ramsdell J S.Ultrasensitive detection of domoic acid in mouse blood by competitive ELISA using blood collection cards[J].Toxicon,2005,45(5): 607-613.

[36]Tsao Z J,Liao Y C,Liu B H,et al.Development of a monoclonal antibody against domoic acid and its application in enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunostrip [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13): 4 921-4 927.

[37]Shaw I,O'Reilly A,Charleton M,et al.Development of a high-affinity anti-domoic acid sheep scFv and its use in detection of the toxin in shellfish [J].Analytical Chemistry,2008,80(9): 3 205-3 212.

[38]許道艷,劉仁沿,董玉華,等.失去記憶性貝毒 ASP酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究 [J].海洋環(huán)境科學(xué),2007,26(3): 237-240.

[39]Zhao J Y,Thibault P,Quilliam M A.Analysis of domoic acid and isomers in seafood by capillary electrophoresis [J].Electrophoresis,1997,18: 268-276.

[40]李大志,祝文君,宋文斌,等.記憶缺失性貝類毒素的主要成分——軟骨藻酸的毛細(xì)管電泳分析 [J].色譜,2002,20(2): 125-128.

[41]Kvasni?ka F,?ev?ík R,Vold?ich M.Determination of domoic acid by on-line coupled capillary isotachophoresis with capillary zone electrophoresis [J].Journal of Chromatography A,2006,1113(1-2):255-258.

[42]Quilliam M A,Thomas K,Wright J L C.Analysis of domoic acid in shellfish by thin-layer chromatography [J].Natural Toxins,1998,6(3-4): 147-152.

[43]Van Dolah F M,Finley E L,Haynes B L,et al.Development of rapid and sensitive high throughput pharmacologic assays for marine phycotoxins [J].Natural Toxins,1994,2(4): 189-196.

[44]Scholin C A,Gulland F,Doucette G J,et al.Mortality of sea lions along the central California coast linked to a toxic diatom bloom [J].Nature,2000,403(6 765): 80-84.

[45]Stevens R C,Soelberg S D,Eberhart B T L,et al.Detection of the toxin domoic acid from clam extracts using a portable surface plasmon resonance biosensor [J].Harmful Algae,2007,6(2):166-174.

[46]Lotierzo M,Henry O Y F,Piletsky S,et al.Surface plasmon resonance sensor for domoic acid based on grafted imprinted polymer [J].Biosensors and Bioelectronics,2004,20(2): 145-152.

A critical review for determination methods of the marine algal toxin-domoic acid

GU Jia-ping,YUAN Tao
(School of Environmental Science and Engineering,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

X55

A

1001-6932(2010)04-0472-06

2009-06-17；

2009-12-08

海洋赤潮災(zāi)害立體監(jiān)測(cè)技術(shù)與應(yīng)用國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金資助課題重點(diǎn)項(xiàng)目 (200801 )

顧佳萍 (1985－)，女，上海人，碩士研究生，環(huán)境科學(xué)專業(yè)，主要從事水環(huán)境新生污染物的研究。電子郵箱：feixuezhuangzhu@sina.com

袁濤，副教授，碩士生導(dǎo)師。電子郵箱：taoyuan@sjtu.edu.cn