陳勃江 綜述 李為民 審校

肺癌是目前對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的惡性腫瘤之一，全球每年約有135萬(wàn)人被確診為肺癌，120萬(wàn)人死于肺癌[1]。雖然醫(yī)學(xué)技術(shù)有了長(zhǎng)足發(fā)展，但肺癌患者的5年生存率并未得到明顯改善，僅為15%左右[1]。其根本原因在于肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚、臨床缺乏有效的早期診斷和治療手段。病理學(xué)上，肺癌分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），后者約占80%-85%。20世紀(jì)90年代以來(lái)，信號(hào)傳導(dǎo)通路逐漸成為腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）因其處于多條信號(hào)通路的交叉點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。

1 Akt 的研究現(xiàn)狀

Akt是存在于人類(lèi)染色體基因組中鼠類(lèi)胸腺淋巴瘤病毒（T-8 strain from AKR/J mouse, AKT8）致癌基因（v-Akt）的同源物，其編碼的蛋白質(zhì)Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因與蛋白激酶A、C高度同源，又名蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）[2]。Akt經(jīng)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K） 活化后，磷酸化其下游多種底物，參與細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞生物學(xué)行為，主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞的乏氧耐受性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和組織血管生成等，從而參與多種腫瘤的發(fā)生[3]。隨著研究的深入，現(xiàn)已基本繪制了以Akt為中心的信號(hào)通路圖（圖1）。

圖1 Akt信號(hào)通路圖Fig 1 Signaling pathway of Akt

Akt家族包括Akt1、Akt2、Akt3三種亞型，其中Akt2是最重要的一種，不僅具有Akt的普遍特征，還有其獨(dú)特的生物學(xué)功能，主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，約10%-20%的原代胰腺癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞株存在Akt2的擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)。當(dāng)用Akt2反義核苷酸轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞后，腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑，且僅局限于管腔內(nèi)；而導(dǎo)入正義核苷酸的對(duì)照組腫瘤細(xì)胞，其生長(zhǎng)則無(wú)明顯變化，并侵入管壁。此現(xiàn)象表明Akt2的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[7-10]。Rychahou等[11]用qRT-PCR的方法檢測(cè)了86例結(jié)腸癌患者腫瘤組織和正常結(jié)腸組織中Akt2 mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的Akt2 mRNA是正常組織的8倍-10倍；隨后對(duì)36例有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者的正常組織、結(jié)腸癌原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：超過(guò)80%的病例的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶存在Akt2的高表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Akt2對(duì)細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響，他們用特異性的Akt2 siRNA載體感染已被熒光素標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，并以空轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞為對(duì)照，將細(xì)胞注入裸鼠脾臟。4周后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠均未出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組則出現(xiàn)明顯的多發(fā)肝臟轉(zhuǎn)移灶。該研究從不同的水平說(shuō)明了Akt2在促進(jìn)結(jié)腸癌形成和轉(zhuǎn)移中的重要作用，與其在前列腺癌及腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的結(jié)果基本一致[12,13]。

關(guān)于Akt在NSCLC中的研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中，Akt2基因的重要功能位點(diǎn)（激酶區(qū)）低突變，而Akt1與Akt3則未見(jiàn)突變，提示Akt2基因突變可能是促進(jìn)肺癌發(fā)生的重要原因[14]。Nishioka等[15]用煙草的主要致癌物質(zhì)之一亞硝胺吡啶基丁酮（NNK）處理小鼠支氣管上皮細(xì)胞，1小時(shí)后即檢測(cè)到細(xì)胞中的Akt被激活，形成磷酸化Akt（phosphorylated Akt, p-Akt）。Binaifer等[16]利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)p-Akt在支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)16例發(fā)育不良或化生的支氣管上皮組織中p-Akt為陽(yáng)性，9例增生組織呈弱陽(yáng)性，而所有的正常組織則均為陰性。進(jìn)一步對(duì)110例NSCLC組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NSCLC中p-Akt的陽(yáng)性率為51%（56/110），明顯高于正常組織，且免疫組織化學(xué)染色提示56例腫瘤組織均表達(dá)p-Akt2。以上研究提示：Akt尤其是Akt2的活化可能是導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞惡變的重要早期事件。

Park等[17]將細(xì)胞間粘附分子-3（intercellular adhesion molecule-3, ICAM-3）基因過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入NSCLC NCI-H1299細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的Akt被激活，繼而細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增加。我國(guó)學(xué)者[18]也證實(shí)肺腺癌細(xì)胞的Akt的活化與細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)。另有動(dòng)物試驗(yàn)[16]顯示，p-Akt不僅能在體外促進(jìn)細(xì)胞的遷移，而且還能在體內(nèi)增強(qiáng)氣道上皮細(xì)胞對(duì)粘膜的侵蝕，促進(jìn)氣道腫瘤的生長(zhǎng)。

關(guān)于Akt與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，目前的研究結(jié)果尚不完全一致。Shah等[19]分析了82例NSCLC患者病灶組織中p-Akt的表達(dá)與患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示：p-Akt高表達(dá)組較低表達(dá)組生存時(shí)間更長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）；而另一項(xiàng)納入335例NSCLC患者的研究[20]結(jié)果則與之相反，單因素和多因素分析均提示：高水平的p-Akt是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，Binaifer[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在110例NSCLC患者中，p-Akt陽(yáng)性組與陰性組的中位生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（23個(gè)月 vs 26個(gè)月，P=0.796 4）。

圖2 PDK1的作用機(jī)制Fig 2 Mechanism of the action of PDK1

2 Akt上游信號(hào)通路蛋白分子——PDK1的研究現(xiàn)狀

業(yè)已證明，Akt屬酯類(lèi)激酶家族，其活化依賴(lài)于上游信號(hào)分子的作用。當(dāng)細(xì)胞受到胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等胞外信號(hào)刺激時(shí)，PI3K的P110催化亞基被激活，磷酸化二磷酸酯酰肌醇［phosphtidylinositol (4,5)-bisphosphate, PIP2］生成三磷酸酯酰肌醇［phos-phatidylinositol (3,4,5)- triphosphate, PIP3］，誘導(dǎo)無(wú)活性的Akt和PDK1從細(xì)胞質(zhì)易位至細(xì)胞膜，同時(shí)使Akt的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出Thr308和Ser473磷酸化位點(diǎn)。位于細(xì)胞膜的Akt與PDK1相互靠近，PDK1催化Akt磷酸化，使其活化[21]，見(jiàn)圖2。由此可見(jiàn)，PDK1是Akt的重要上游調(diào)節(jié)分子。

Liu等[22]觀察到EGF誘導(dǎo)細(xì)胞中PDK1和Akt共易位。當(dāng)用PDK1 siRNA干擾乳腺癌細(xì)胞PDK1的表達(dá)時(shí)，Akt的磷酸化水平明顯降低，且細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和趨化能力明顯受損。在裸鼠體內(nèi)，PDK1 siRNA干擾的乳腺癌細(xì)胞成瘤速度緩慢，且不能形成肺部轉(zhuǎn)移病灶。Lee等[23]用PDK1抑制劑OSU-03012處理惡性神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞，亦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖減慢，凋亡增加，體內(nèi)成瘤能力下降。

然而，目前鮮有關(guān)于PDK1在NSCLC中的作用及其對(duì)Akt的調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道。筆者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)PDK1和Akt在NSCLC組織中的表達(dá)均增高，推測(cè)PDK1可能參與Akt的活化，進(jìn)而影響NSCLC的發(fā)生。

3 Akt下游信號(hào)通路蛋白分子——Raf-1和p70S6K的研究現(xiàn)狀

現(xiàn)已證實(shí)，Raf是一種原癌基因，其編碼產(chǎn)物為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要參與Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)。Raf有3種同型異構(gòu)體，分別為A-Raf、B-Raf和C-Raf（Raf-1）。B-Raf的作用機(jī)制目前已較清楚，而Raf-1的功能則了解較少，一般認(rèn)為與細(xì)胞的抗凋亡作用有關(guān)[24]。近年來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Raf-1除了通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK通路發(fā)揮作用外，還存在非MEK/ERK依賴(lài)機(jī)制。Raf-1被Akt磷酸化后，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[25]。p70S6K是Raf-1的作用底物之一，它是核糖體40s小亞基S6蛋白激酶，被Raf-1活化后，促進(jìn)含5’-末端寡聚嘧啶（5’-terminal oligopolypyrimidine,5’-TOP）mRNA的翻譯，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等[26]。

Jilavean等[27]檢測(cè)了263例痣和523例惡性黑色素瘤組織中Raf-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織Raf-1的水平較痣明顯增高（P＜0.000 1），且轉(zhuǎn)移灶較原發(fā)灶更高（P=0.022 5）。用Raf-1 siRNA干擾惡性黑色素瘤細(xì)胞株Raf-1的表達(dá)，細(xì)胞凋亡增加。Lyustikman等[28]的研究結(jié)果也顯示：神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Raf-1的表達(dá)增高；將Raf-1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞惡變形成神經(jīng)膠質(zhì)瘤。目前尚未在NSCLC組織中檢測(cè)到Raf-1的基因突變；Raf-1轉(zhuǎn)基因小鼠的肺內(nèi)腺瘤形成的發(fā)生率也較低，存在時(shí)間亦較短[29]。然而，Cekanov等[30]利用煙草致癌原NNK誘導(dǎo)倉(cāng)鼠發(fā)生肺腺癌，并用NNK處理人氣道上皮細(xì)胞。5周、10周和20周后，倉(cāng)鼠肺微腺瘤及人氣道上皮細(xì)胞均被檢出有Raf-1的高表達(dá)，且呈時(shí)間依賴(lài)性增加。該實(shí)驗(yàn)提示Raf-1可能與肺腺癌的形成有關(guān)，是肺腺癌發(fā)生的早期標(biāo)志物之一。實(shí)際上，早在20世紀(jì)90年代，就有學(xué)者利用反義寡核苷酸技術(shù)來(lái)特異性阻斷NSCLC組織中Raf-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞出現(xiàn)包括染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂、annexin V結(jié)合等在內(nèi)的凋亡現(xiàn)象，最終細(xì)胞死亡[31]。Kerkhoff等[29]的分析進(jìn)一步顯示：肺癌細(xì)胞株中Raf-1蛋白激酶表達(dá)水平的升高可能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。因此臨床上出現(xiàn)了利用Raf激酶抑制劑BAY 43-9006治療NSCLC的方法。2005年在美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology, ASCO）會(huì)議上，Adjei等[32]首次報(bào)道了12例NSCLC患者的BAY43-9006 I期臨床試驗(yàn)結(jié)果：1例患者達(dá)部分緩解；8例（67%）患者處于疾病穩(wěn)定期，其中2例長(zhǎng)達(dá)24周。

p70S6K在乳腺癌及消化道腫瘤中的作用研究較多，而其與NSCLC的關(guān)系則報(bào)道相對(duì)較少。多項(xiàng)研究[33-35]表明，p70S6K在乳腺癌、肝癌、食道癌、膽囊癌等腫瘤組織中高表達(dá)，且磷酸化水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)或死亡等明顯正相關(guān)。p70S6K對(duì)NSCLC意義的研究中，Shen等[36]用高通量免疫印跡、Western blot和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)肺腺癌和正常支氣管上皮組織中p70S6K的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)p70S6K在肺腺癌組織中增高，故其在肺腺癌的鑒別診斷中有一定價(jià)值。本課題組在前期研究中探討了Raf-1和p70S6K在不同病理類(lèi)型NSCLC中的表達(dá)，結(jié)果顯示Raf-1在肺腺癌和鱗癌組織中均呈高表達(dá)；而p70S6K則在肺腺癌組織中表達(dá)增高，在鱗癌組織中陰性表達(dá)。因此，Akt/Raf-1在肺腺癌和鱗癌組織中是否均通過(guò)作用于底物p70S6K而發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步的研究和分析。

4 小結(jié)

綜上所述，現(xiàn)有的研究已經(jīng)提示PDK1、Akt、Raf-1和p70S6K四種蛋白質(zhì)參與了包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生。然而，以Akt為中心的PDK1/Akt/p70S6K信號(hào)通路在NSCLC中的作用機(jī)制尚有待于系統(tǒng)的深入研究，以期進(jìn)一步明確NSCLC的發(fā)生機(jī)制，探尋NSCLC早期診斷的分子標(biāo)志物和靶向治療新靶點(diǎn)。