呂旭聰,黃志清,黃若蘭,黃彬紅,饒平凡,倪莉

(福州大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)研究所,福建福州,350108)

反相高效液相色譜法同時快速測定黃酒和葡萄酒中有機酸的含量＊

呂旭聰,黃志清,黃若蘭,黃彬紅,饒平凡,倪莉

(福州大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)研究所,福建福州,350108)

建立了利用反相高效液相色譜法同時快速測定黃酒和葡萄酒中酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等 7 種有機酸的方法。采用的色譜柱為 X B-C18(5μm,150 mm×4.6 mm),檢測器為紫外檢測器,波長210 nm;確定的最優(yōu)色譜條件是:0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH 2.3,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進樣量10.0μL,沖洗方式為等度洗脫。利用此方法分析測定有機酸的工作曲線線性關(guān)系良好,回收率在83.17%～117.3%,變異系數(shù)在3.1%～5.8%。利用研究所構(gòu)建的反相高效液相色譜法能夠快速地對黃酒和葡萄酒中的有機酸進行測定,滿足企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量進行實時監(jiān)控。

反相高效液相色譜法(RP-HPLC),同時分析測定,黃酒,葡萄酒,有機酸

在食品工業(yè)中,不少食品和飲料都與有機酸有關(guān),這些有機酸和其他香味成分一起,賦予了食品一定的口感。俗話說:“無酸不成酒”,說明酸在酒中有著重要的作用[1-4]。實際上酸是酒體的重要組成部分,同時各種有機酸又是酒產(chǎn)香的前體物質(zhì):酸能有效增強酒的濃厚感,降低甜度,并且具有緩沖、協(xié)助其他香味成分的作用[5-6]。然而,酒中有機酸種類和含量也并不是越多越好,因此有必要構(gòu)建一種快速分析酒中有機酸含量的方法。

有機酸的檢測方法有很多種[7-10],但是這些方法一般要進行預(yù)分離、衍生化等繁瑣的前處理,而且能達到同時分離的有機酸種類較少,目前最為成熟的技術(shù)就是高效液相色譜技術(shù)。近些年利用高效液相色譜法測定有機酸的報道較多[11-13],研究大多利用高效液相色譜法測定葡萄酒中的有機酸含量[14-15]。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)廣泛用于測定有機酸,不僅簡單快速,且選擇性好,準(zhǔn)確度高。試驗中采用反相高效液相色譜替代離子交換色譜同時分離7種有機酸,對包括流動相的組成、流動相pH等對分離效果具有影響的參數(shù)等進行了優(yōu)化,建立了適合有機酸分離的優(yōu)化參數(shù),并對幾種黃酒和葡萄酒中有機酸的類型及含量進行定性、定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

國優(yōu)名酒“鼓山”福建老酒、古越龍山陳年花雕、3年陳會稽山紹興花雕酒、惠澤龍印象閩派黃酒(3年)、惠澤龍閩派黃酒(10年)、青紅酒、閩樂青酒、閩樂紅8年花雕黃酒、長城干白葡萄酒(2000年)、張裕精品干紅葡萄酒(1995年)。以上產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑

儀器:日本島津LC-3A型高效液相色譜儀;XBC18色譜柱;SPD-1紫外分光光度檢測器;PB303-E電子天平(梅特勒-托利多儀器公司);pHB-3便攜式pH計(上海偉業(yè)儀器廠);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);5415R型臺式高速離心機(eppendorf公司)。

試劑:標(biāo)準(zhǔn)品酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸均為國產(chǎn)分析純;磷酸二氫鉀和磷酸為分析純;配制試劑所用的水為經(jīng)Milli-QⅡ純水處理裝置處理過的超純水。

有機酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備:酒石酸 0 .5000 g,蘋果酸0.5000 g,檸檬酸 0 .5000 g,琥珀酸0.5000 g,甲酸0.44 mL,乙酸0.5000 mL,乳酸0.425 mL定容于100 mL容量瓶中,所配溶液均經(jīng) 0 .45μm微孔濾膜過濾,水為超純水。

1.3 色譜分析條件

色譜柱:XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm;流動相為0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),用磷酸調(diào)pH值至2.3;流速1.0 mL/min;紫外檢測波長:210 nm;柱溫:30℃;進樣量:10.0μL,沖洗方式為等度洗脫,峰面積用外標(biāo)法定量。

1.4 實驗方法

1.4.1 檢測波長的選擇

為考察檢測波長對有機酸檢測靈敏度的影響,用190～400 nm紫外光對草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸分別進行掃描,各酸在210 nm左右均有較大吸收峰,最大吸收波長均在210 nm左右,所以把檢測波長暫定在210 nm。

1.4.2 有機酸的分離

在反相C18柱上以KH2PO4-H3PO4緩沖液為流動相,觀察流動相中KH2PO4濃度、流動相pH值、流速對7種有機酸分離的影響,選擇適宜的分離條件,測定各有機酸的保留值。

1.4.3 樣品處理與分析

樣品預(yù)處理:取10 mL酒液,離心(10000 r/min,15 min)2次,除去水不溶物,然后用0.45μm孔徑的濾膜過濾即得到待測液。

1.4.4 定性與定量

在相同的色譜條件下,將樣品色譜圖與有機酸標(biāo)準(zhǔn)液進行對照,根據(jù)確定樣品中的各有機酸峰的保留時間來進行定性。還可以在樣品液中加入一定量的有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察在相同的保留時間下,峰高是否增加,以此來進行定性分析;在標(biāo)樣與樣品進樣量相同的情況下,應(yīng)用外標(biāo)法定量,可計算出樣品中各有機酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

常 用 的 緩 沖 液 以 KH2PO4、NaH2PO4及(NH4)2HPO4居多,這3種緩沖溶液均可成功實現(xiàn)復(fù)雜體系有機酸的分離,此外也有采用H2SO4溶液分離有機酸的報道。本研究選擇濃度為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-乙腈(98∶2)pH值2.3和0.005 mol/L的H2SO4溶液pH值2.0為流動相,對7種有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣進行分離,分離圖譜見圖1和圖2。試驗結(jié)果表明,采用0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-乙腈(98∶2)作為有機酸分離的流動相分離效果較好,圖1中有機酸的出峰順序是:酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸。而采用pH值2.0的0.005 mol/L H2SO4溶液為流動相時,有機酸出峰明顯少,而且峰形不對稱,甚至峰與峰之間沒有達到基線分離,無法進行定性定量分析,這可能跟色譜柱的類型及分離能力有一定的關(guān)系。

圖1 七種有機酸標(biāo)樣的色譜圖

圖1有機酸的出峰順序能夠與理論相吻合[16],在RP-HPLC中,被分離組分極性越弱,與鍵合相表面烷基之間色散力就越強,容量因子K就越大。相反,極性越強,即分子含羥基數(shù)和羧基數(shù)越多,與流動相溶劑分子形成的氫鍵就越強,K就越小。檸檬酸和琥珀酸都含有2個可與鍵合相表面烷基產(chǎn)生色散力的亞甲基,且檸檬酸的亞甲基的2個亞甲基被帶有部分正電荷的碳原子隔開,故其烷基間的色散力小于琥珀酸,故實際K的順序為:酒石酸<甲酸<蘋果酸<乳酸<乙酸<檸檬酸<琥珀酸。

圖2 七種有機酸在流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液(pH值2.00)的色譜圖

2.1.2 流動相最佳pH值

流動相的pH值對各種有機酸的分離效果具有十分重要的作用。所謂離子抑制法就是,在較低的pH值抑制酒中有機酸的電離,其大多數(shù)有機酸以有機酸分子的形式存在于酒中,從而使其能在C18柱中有較好的保留。流動相pH值選擇的原則一般根據(jù)有機酸的pKa值來定。酒中的有機酸均為弱酸,在水溶液中存在著解離平衡,解離程度受溶液pH值的影響?？紤]到色譜柱要求使用的流動相pH值范圍為2.0≤pH≤9.0,將緩沖液的pH分別用磷酸調(diào)至2.0,2.3,2.5和2.8,經(jīng)4種不同流動相進行分離。結(jié)果表明,隨著pH值的增大,各有機酸的保留時間減少了,特別是出峰比較后面的檸檬酸和琥珀酸隨著pH增大,保留時間減少得比其他幾個有機酸明顯。有報道,提高H+濃度可抑制有機酸的解離,改變峰形。通過比較標(biāo)準(zhǔn)樣在不同pH值下的分離色譜圖以及酒樣在不同pH下的譜圖,最終選擇pH2.3為最佳的pH。

2.1.3 其他分離條件的選擇

美國安捷倫公司提供的Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱、Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm5μm)色譜柱、Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱都能用于有機酸的色譜分離。根據(jù)本研究條件,選擇Zorbax SB-C18(250×4.6 mm 5μm)色譜柱,波長210 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進樣量10.0 μL,沖洗方式為等度洗脫。

2.2 有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸,用超純水配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)有機酸混合溶液。進樣10μL,分別進行HPLC分析。通過線性回歸處理峰面積y和有機酸含量x(g/100 mL)得回歸方程(表1),相關(guān)系數(shù)除酒石酸為0.9983外,其余均在0.999以上,表明線性關(guān)系良好。

表1 各種有機酸的工作曲線及線性相關(guān)性

2.3 檢測方法的評價

2.3.1 方法的回收率

將閩樂8年花雕黃酒酒樣以體積比1∶1加入含有酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的標(biāo)準(zhǔn)液,混合均勻,進樣測定其含量,結(jié)果見表2?；厥章?%=(樣品加標(biāo)后測得量-樣品本底值)/標(biāo)樣加入量。結(jié)果表明,回收率在83.17%～117.3%,方法的準(zhǔn)確度較高。由于黃酒酒樣中酒石酸含量較低,而且在色譜圖上出峰不明顯,因此沒有計算酒石酸的回收率。

表2 有機酸測定方法的回收率試驗結(jié)果

2.3.2 方法的重現(xiàn)性

將閩樂紅酒樣重復(fù)進樣測定4次,以考察方法的重現(xiàn)性。6種有機酸測定結(jié)果見表3,其中變異系數(shù)CV(%)=相對平均偏差(SD)/平均值(X),結(jié)果表明各種有機酸的變異系數(shù)在3.1%～5.8%,重現(xiàn)性較好。

表3 有機酸測定方法的重現(xiàn)性試驗結(jié)果

2.4 酒樣中有機酸的測定

對不同的酒樣進行分析測定,由于各種酒的釀造工藝不同,所采用的原料也有差異,故其中的有機酸含量也有差異,具體結(jié)果見表4。從表4可以看出,黃酒中乳酸和乙酸的含量相對較高,葡萄酒中酒石酸和蘋果酸的含量相對較高。圖3是長城干白葡萄酒中有機酸的分離圖譜。酒樣的HPLC圖譜中出現(xiàn)那么多的峰的原因可能是酒中的β-苯乙醇、生物胺、氨基酸等出峰。本研究由于實驗條件限制,對于一些峰未能進行進一步的定性定量分析。

表4 九種酒樣種有機酸的含量

圖3 白葡萄酒的分離譜圖

3 結(jié)論

采用高效液相色譜測定酒中的有機酸含量,確定了分離條件:色譜柱為XB-C18,5μm,150 mm×4.6 mm,紫外檢測器,波長210 nm,流動相為0.02 mol/L KH2PO4-乙腈(98∶2),pH值2.3,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進樣量10.0μL,沖洗方式為等度洗脫。標(biāo)定了7種有機酸的濃度-峰高標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)在0.9983～0.9999。

在優(yōu)化的HPLC分析條件下,對市售的黃酒和葡萄酒中7種有機酸進行了定量、定性,分別是酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸。從測定的結(jié)果可以看出,黃酒中乳酸和乙酸在所測的7種有機酸中含量最高,葡萄酒中蘋果酸和酒石酸在所測的7種有機酸中含量最高,此法的回收率在83.17%～117.3%,變異系數(shù)在3.1%～5.8%?？疾斓挠袡C酸出峰時間都在6 min之內(nèi),能夠快速地對黃酒、葡萄酒中的有機酸進行測定,滿足企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量進行實時監(jiān)控的要求。

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ABSTRACTThis paper established a method using RP-HPLC simultaneously and rapidly detecting of tartaric acid,for mic acid,malic acid,lactic acid,acetic acid,citric acid,succinic acid in rice wine and grape wine.The optimal separation conditions:the XB-C18(5μm,150mm×4.6mm)ultraviolet detector,wavelength 210 nm,mobile phase 0.02M KH2PO4-acetonitrile(98:2),pH 2.3,flow rate 1.0 ml/min,column temperature 30℃,injection of 10.0μl,Isocratic elution.The recovery rate ranged from 83.17 to 117.3%,and the relative standard deviations are 3.1%～5.8%.Reverse-phase high performance liquid chromatography can determine the organic acid in yellow rice wine and wine rapidly,which satisfy enterprises needs for real-t ime monitoring and quality control.

Key wordsreverse-phase,HPLC,s imultaneous determination,rice wine,wine organic acids

S imultaneousDeterm ination of Organic Acids in Wine with Reverse-phase High Performance L iquid Chromatography

Lv Xu-cong,Huang Zhi-qing,Huang Ruo-lan,Huang Bin-hong,Rao Ping-fan,NiLi
(Research Institute of Food Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,CHina)

博士(倪莉副教授為通訊作者,E-mail:nili@fzu.edu.cn)。

＊福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.S W2006-16),福建省教育廳資助項目(No.JA 07022),福建省自然科學(xué)基金計劃資助項目

2009-12-02,改回日期:2010-01-06