超聲波輔助堿水提枳實(shí)中橙皮苷的研究

陳曉偉，陳榮燕，韋媛媛，廖蘭，覃燕玲

（廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006）

超聲波輔助堿水提枳實(shí)中橙皮苷的研究

陳曉偉，陳榮燕，韋媛媛，廖蘭，覃燕玲

（廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006）

采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討超聲輔助提取枳實(shí)中橙皮苷的最佳工藝。枳實(shí)樣品堿化后用乙醇超聲輔助提取，用分光光度法測(cè)定橙皮苷含量。最優(yōu)提取條件為：4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH為13），50℃超聲提取3次每次50 min，加HCl調(diào)節(jié)pH至7，靜置析晶10 h，3批枳實(shí)樣品橙皮苷平均含量為32.3 mg/g。超聲輔助堿水提取枳實(shí)中橙皮苷的方法簡(jiǎn)便可行。

枳實(shí)；橙皮苷；超聲波輔助提??；正交試驗(yàn)；含量測(cè)定

Abstract:To study on the ultrasonic-associated alkali extraction of hesperidin from Citrus aurantium by singlefactor and orthogonal test.Hesperidin was extracted with ethanol-NaOH and determined by UV-visiblespectrophotometry.The optimal ultrasound-associated extraction conditions were 4 times the mass of 65%ethanol-NaOH (pH=13)at 50℃for 50 minitus and extracting 3 times,the extract was precipitated for 10 hours at pH=7.The content of hesperidin was 32.3 mg/g.The optimal extraction technology was stable and feasible.

Key words：citrus aurantium;hesperidin;ultrasonic-associated extraction;orthogonal test;content determination

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳實(shí)具有破氣消積，化痰散痞等功效[1]可入藥使用，早在中藥典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。枳實(shí)中主要含有黃酮、生物堿及揮發(fā)油等成分。橙皮苷屬雙氫黃酮糖苷類(lèi)化合物，具有抗氧化、抑菌、消炎等作用[2]，可作為藥品和食品保鮮劑應(yīng)用。傳統(tǒng)工藝大多采用Ca(OH)2堿提酸沉法直接提取枳實(shí)中橙皮苷，近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道[3]以有機(jī)溶劑輔助堿提酸析提取橙皮苷，提高了提取率，而超聲波具有強(qiáng)大的“空化效應(yīng)”能加速橙皮苷的大量浸出[4]，因而本研究結(jié)合超聲波法和有機(jī)溶劑輔助堿水提取枳實(shí)中橙皮苷，通過(guò)實(shí)驗(yàn)尋找出最佳條件。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

220V 50HZ超聲波清洗儀：必能信超聲有限公司；ZX-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市英峪予華儀器廠；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼科儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

枳實(shí)藥材：購(gòu)于柳州老百姓大藥房；橙皮苷對(duì)照品：科翔生物科技有限公司；乙醇、甲醇、NaOH、HCl等均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

枳實(shí)粉末50 g→加入pH=13的乙醇-NaOH溶液200 mL→超聲波提取→減壓抽濾→濾液用HCl調(diào)節(jié)pH值→靜置結(jié)晶→減壓抽慮→洗滌提取物至洗滌液無(wú)色→70℃恒溫烘干→稱重→得到提取物

2.2 樣品中橙皮苷含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對(duì)照品4.0 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得濃度為0.080 mg/mL橙皮苷對(duì)照品貯備液。

2.2.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥提取物1.0mg，用甲醇定容至10mL，即為樣品溶液。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取橙皮苷對(duì)照品液、樣品液適量、溶劑甲醇、乙醇，以空白溶液作參比，用紫外掃描儀，于200 nm～400 nm范圍，掃描其最大吸收峰。結(jié)果表明，對(duì)照品和樣品溶液在284 nm處有最大吸收，同時(shí)溶劑在此波長(zhǎng)下無(wú)干擾，故選擇284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取橙皮苷對(duì)照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以第1管作空白對(duì)照，在284 nm處測(cè)吸光度。以橙皮苷對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，橙皮苷在0.008 mg/mL～0.080 mg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系，得到回歸曲線方程為：Y=18.055X+0.0129，r=0.9990（n=6）。

2.3 枳實(shí)提取單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)提取橙皮苷的影響

稱取枳實(shí) 50.0 g，加入料液比分別為 1∶2、1∶3、1∶4、1∶6（mL/g）的 pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，加熱至 30℃，超聲30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，按2.2.2法制備樣品溶液，并測(cè)定橙皮苷含量。結(jié)果見(jiàn)圖1，料液比為1∶4（mL/g）時(shí)，橙皮苷的提取率達(dá)到高峰。

圖1 提取液用量對(duì)橙皮苷含量的影響Fig.1 Effects of different amounts of extract fluid on the content of hesperidin

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)提取橙皮苷的影響

稱取枳實(shí) 50.0 g，加入料液比為 1∶4（mL/g）的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，提取時(shí)控制溫度為30℃，超聲提取 10、20、30、40、50、60 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測(cè)定橙皮苷含量。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)橙皮苷含量的影響Fig.2 Effects of the extraction time on the content of hesperidin

在50 min以后橙皮甙含量有明顯的下降趨勢(shì)。其原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲波空化作用對(duì)于橙皮甙結(jié)構(gòu)有一定的破壞，使橙皮甙的產(chǎn)量有所下降。故應(yīng)選擇在30 min～50 min內(nèi)最好。

2.3.3 超聲溫度對(duì)提取橙皮苷的影響

稱取枳實(shí)50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，分別控制溫度30、40、50、60℃下進(jìn)行提取30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測(cè)定橙皮苷含量。結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著溫度升高橙皮甙含量會(huì)逐漸增加，50℃時(shí)溶液浸提效果最好，溫度繼續(xù)升高時(shí)，浸提效率將降低。且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)溫度高于60℃后成品顏色發(fā)黑，溶出的非橙皮甙成分增加。

圖3 溫度對(duì)橙皮苷含量的影響Fig.3 Effect of the extraction temperature on the content of hesperidin

2.3.4 超聲次數(shù)對(duì)提取橙皮苷的影響

稱取枳實(shí)50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH 溶液，溫度 30℃提取 1、2、3、4次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl調(diào)節(jié)pH=7,靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測(cè)定橙皮苷含量，結(jié)果表明，表明超聲次數(shù)從1～3次橙皮甙含量越來(lái)越高，但提取到第4次時(shí)橙皮甙含量略有下降，因此超聲次數(shù)選擇在3次以內(nèi)，可以節(jié)省時(shí)間和資源又可以提高產(chǎn)率，見(jiàn)圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)橙皮苷含量的影響Fig.4 Effects of the numbers of extraction on the content of hesperidin

2.3.5 酸沉pH值的選擇

稱取枳實(shí)50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，溫度50℃提取3次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl分別調(diào)節(jié)pH=5、6、7，靜置5 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測(cè)定橙皮苷含量。結(jié)果表明pH=7時(shí)提取物中橙皮苷含量最高。

2.3.6 靜置時(shí)間的選擇

稱取枳實(shí)50.0 g，加入料液比為1∶4的pH=13、65%乙醇-NaOH溶液，溫度50℃提取3次，每次30 min，減壓抽濾除去濾渣，濾液用HCl分別調(diào)節(jié)pH=7，分別靜置 4、6、8、12、16 h，減壓抽濾，洗滌沉淀，烘干，并測(cè)定橙皮苷含量。靜置時(shí)間越長(zhǎng)橙皮甙含量越高，但靜置10 h后提取率幾乎趨于平衡。

2.4 正交試驗(yàn)

由于超聲波輔助堿水提取過(guò)程對(duì)提取率的影響較大，因此在單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間（A）、料液比（B）、超聲次數(shù)（C）、超聲溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，按照L9（34）正交表安排試驗(yàn)見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由極差分析結(jié)果得，各因素對(duì)橙皮苷提取量的影響順序?yàn)椋篋（超聲溫度）＞C（超聲次數(shù)）＞A（超聲時(shí)間）＞B（料液比）。最優(yōu)組合方案為D2C3A3B1，即溫度為50℃，超聲3次每次50 min，料液比為1∶4橙皮苷提取率最高。

2.5 最優(yōu)方案驗(yàn)證

按照2.4優(yōu)化條件提?。悍Q取3份枳實(shí)粉末各約50g，加入65%乙醇-NaOHpH值為13的溶液200mL，置于超聲波提取器中控制溫度為50℃，超聲3次，每次50 min，減壓抽濾，濾液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH=7，靜置10 h，減壓抽慮，用去離子水洗滌產(chǎn)品至洗滌液無(wú)色。將提取物70℃恒溫烘干，稱重，準(zhǔn)確稱取提取物1.0mg，用甲醇定容成10 mL，制備為樣品溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在284 nm處測(cè)其吸光度，并計(jì)算枳實(shí)中橙皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of samples

從表3可看出，最佳提取工藝條件具有較好重復(fù)性，橙皮苷得率較高，說(shuō)明該工藝條件合理可靠。

3 結(jié)論

堿提酸沉的原理是利用橙皮甙在堿性條件下開(kāi)環(huán)溶解進(jìn)行提取，酸性條件下閉環(huán)沉淀進(jìn)行分離。傳統(tǒng)工藝中常用生石灰，由于生石灰在水中的黏性較大，對(duì)藥材有一定包裹作用，不利于橙皮苷的提取，而采用NaOH沒(méi)有上述缺點(diǎn)[5]，本試驗(yàn)中采用毒性較小的乙醇?jí)A液提取，可提高橙皮苷提取率，文獻(xiàn)表明[3]提取液以pH=13為最佳，提取液澄清易過(guò)濾。

本文采用超聲波輔助堿水提取枳實(shí)中橙皮苷，通過(guò)單因素考察了超聲波堿水提取和酸沉工藝，并用正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波堿水提取工藝參數(shù)，結(jié)合橙皮苷含量測(cè)定，確定最適工藝條件為：采用4倍量65%乙醇-NaOH溶液（pH為13）50℃超聲3次每次50 min，加HCl調(diào)節(jié)pH=7，靜置析晶10 h，將提取產(chǎn)物用分光光度法進(jìn)行橙皮苷含量測(cè)定，3批枳實(shí)樣品橙皮苷平均含量為32.3 mg/g。結(jié)果表明提取產(chǎn)率較高，方法簡(jiǎn)便可行。

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Study on the Ultrasonic-Associated Alkali Extraction of Hesperidin from Citrus Aurantium

CHEN Xiao-wei,CHEN Rong-yan,WEI Yuan-yuan,LIAO Lan,QIN Yan-ling
（Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China）

2009-09-29

廣西工學(xué)院2009年大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(No.2009030)；廣西教育廳科研項(xiàng)目(200911LX185)

陳曉偉（1976—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)。