朱 姁，潘道東,2,*

發(fā)酵乳桿菌細胞壁蛋白酶的提取

朱 姁1，潘道東1,2,*

(1.南京師范大學 國家乳品加工技術研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江 寧波 315211)

確定提取發(fā)酵乳桿菌細胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取條件。在單因素試驗的基礎上，采用多指標正交試驗設計和綜合平衡分析法研究溶菌酶結合非離子表面活性劑法提取發(fā)酵乳桿菌細胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取條件。結果表明：裂解液的成分為50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、體積分數(shù)3%吐溫-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9；提取條件為裂解液與菌體的比例10:1(V/m)、保溫時間5h、保溫溫度37℃時酶比活力達38.957U/mg，此時可最大效率的獲得發(fā)酵乳桿菌的細胞壁蛋白酶。

發(fā)酵乳桿菌；細胞壁蛋白酶；提取

據(jù)專家推測，2025年全世界將有超過15億高血壓患者。在高血壓人群中有95%以上的患者屬于原發(fā)性高血壓，利用酶學或微生物發(fā)酵技術制備血管緊張素轉移酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)抑制肽或制成相應的食品，且具有有效降低原發(fā)性高血壓的效果，且相對于合成降壓藥更安全可靠、無副作用。研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌在發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶能分解乳蛋白產(chǎn)生多肽，對ACE具有抑制作用[1-3]。細胞壁蛋白酶(cellenvelope proteinase，CEP)是乳酸菌蛋白水解過程中的第一個酶，扮演了一個非常重要的角色，前人用純化的CEP水解乳蛋白發(fā)現(xiàn)，CEP可以單獨水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽，所以，對于CEP的研究至關重要，但是現(xiàn)在國內(nèi)外對CEP的研究主要是乳球菌類，乳桿菌類也僅限于瑞士乳桿菌，本實驗將嘗試從發(fā)酵乳桿菌中提取CEP。目前CEP的提取方法主要是Ca2+-free法，Yamamoto等[4]采用此法提取了Lactobacillus helveticus CP790的CEP；本實驗室郭宇星等[5]采用過超聲波處理法提取瑞士乳桿菌的CEP；Coolbeard等[6]用溶菌酶處理法從Lactococcus lactis subsp. cremoris H2中提取到了CEP；Martin-Hernandez等[7]采用Triton X-100和NP-40共同處理Lactobacillus helveticus L89細胞壁，抽提出CEP。本實驗將采用以上3種方法提取發(fā)酵乳桿菌CEP，并且對相對較好的方法進一步優(yōu)化改進，最大效率的從發(fā)酵乳桿菌中獲得CEP，以進一步研究其酶學性質及對乳蛋白的水解度和ACE抑制活性。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)由本實驗室分離保藏。

考馬斯亮藍G-250 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白 南京賽吉科技有限公司；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) 北京賽百盛基因技術有限公司；溶菌酶(酶活力＞20000U/mg) 上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；超凈工作臺 上海上凈凈化食品有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；722-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；CL-22M高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體制備

菌體在固體培養(yǎng)基上連續(xù)活化三代，再接入液體培養(yǎng)基中，按體積分數(shù)3%接種量，37℃條件下擴大培養(yǎng)至生長對數(shù)期(16h)取出，4℃、4500r/min離心20min收集菌體沉淀。用含有30mmol/L Ca2+的50mmol/L Tris-HCl (pH7.1)緩沖液洗滌菌體[5]，4℃、4500r/min離心20min，棄上清液，重復洗滌3次，收集菌體備用。

1.3.2 酶液提取方法[8]

Ca2+-free法：取菌體2g，用含有2mmol/L EDTANa2的50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)10mL重新懸浮菌體，攪勻，在30℃保溫30min，于4℃、4500r/min離心20min，取上清液即為粗酶液。

溶菌酶裂解法：取菌體2g，用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA-Na2、100mmol/L NaCl、體積分數(shù)0.5%Triton X-100、1mg/mL溶菌酶，pH8.5)40mL懸浮菌體，37℃保溫3h，于4℃、4500r/min離心20min，上清液即為粗酶液。

超聲波破碎法：取菌體2g，用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)10mL重新懸浮菌體，攪勻，進行超聲波破碎，超聲波破碎條件為破碎功率300W、破碎時間3s、間隔時間5s、200次。取破碎液于4℃、4500r/min離心20min，取上清液即為粗酶液。

1.3.3 CEP酶活力測定[9]

取0.02mL底物MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) (16.4mmol/L)，酶液0.04mL，1.14mL Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7.8)混合，在37℃保溫60min。用0.5mL、體積分數(shù)30%乙酸終止反應，在410nm波長處測定吸光度(測定時補充2.3mL蒸餾水)?？瞻讓φ展?，以蒸餾水代替酶液同樣條件操作。

酶活力單位定義：37℃，每小時A410nm增加0.10定義為一個酶活力單位(U/mL)。

1.3.4 蛋白質含量測定[10]

采用考馬斯亮藍法。取0.1mL樣品、0.9mL蒸餾水、5mL蛋白試劑(100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%乙醇中，再加100mL 85%磷酸，用雙蒸水補至1000mL)，充分振蕩混勻，5min后于波長595nm處測定吸光度，以1mL重蒸水作為空白對照。

2 結果與分析

2.1 提取方法的確定

Haandrikman等[11]報道提取乳球菌CEP的方法一般都采用Ca2+-free法，此法中加入的EDTA-Na2可以螯合蛋白酶上的Ca2+，Ca2+可以穩(wěn)定CEP的結構，一旦Ca2+缺失，乳球菌細胞壁蛋白酶結構就會改變，CEP就會從細胞壁上解離下來。但在本實驗中采用Ca2+-free法提取發(fā)酵乳桿菌的CEP效果不是很好，說明發(fā)酵乳桿菌的CEP和乳球菌的CEP結構可能存在某些不同。CEP的C-末端含有一段疏水性殘基序列(transmembrane，TM)，其主要功能是錨定在細胞壁上或者細胞膜上[12-13]。有研究報道，采用Ca2+-free法提取出的蛋白酶只是暴露在細胞壁外的N-端序列，所以提取率不高[7]。若要獲得較高提取率，就必須破碎細胞膜，常用的破壁方法有超聲波處理法、溶菌酶處理法和表面活性劑處理法等。于是本實驗嘗試了溶菌酶結合表面活性劑處理法和超聲波處理法提取發(fā)酵乳桿菌的CEP，結果見表1。

表1 CEP提取方法比較Table 1 Comparison among three methods for the extraction of cellenvelope protainase

從表1可以看出，同樣是2g菌體，溶菌酶裂解法可以獲得更高含量的CEP，所以可能是超聲波破碎法破碎程度過于劇烈不適宜提取發(fā)酵乳桿菌的CEP，而采用溶菌酶處理菌體的方式則比較合適。

2.2 溶菌酶裂解法提取CEP

2.2.1 裂解液成分的單因素試驗

2.2.1.1 溶菌酶質量濃度對CEP提取的影響

圖1 溶菌酶質量濃度對CEP提取的影響Fig.1 Effect of lysozyme concentration on the extraction of cellenvelope protainase

溶菌酶通過水解菌體細胞壁的肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵破壞細胞壁[6]，溶菌酶的質量濃度直接關系到CEP的釋放，結果見圖1?？梢姰斎芫纲|量濃度達到2mg/mL時，CEP的釋放量基本達到最大。

2.2.1.2 EDTA-Na2濃度對CEP提取的影響

EDTA-Na2除了可以螯合蛋白酶上的Ca2+，改變CEP的構象外，還對細菌細胞外層膜有破壞作用。細胞外層膜結構通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質來維持，一旦EDTA-Na2將離子螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞外層膜出現(xiàn)洞穴，而CEP的C-末端又錨定于細胞膜上，外層膜的破壞直接導致蛋白酶的脫離。結果見圖2。

圖2 EDTA-Na2濃度對CEP提取的影響Fig.2 Effect of EDTA-Na2concentration on the extraction of cellenvelope protainase

由圖2可知，對于提取發(fā)酵乳桿菌CEP，EDTANa2的作用并不大，甚至當濃度達到一定程度時還會抑制CEP的活性。查文獻[14]可知，EDTA會抑制金屬蛋白酶的活性，據(jù)此可初步推斷CEP可能是金屬蛋白酶，而且這也可能就是Ca2+-free法對發(fā)酵乳桿菌CEP提取效率不高的主要因素之一。

2.2.1.3 非離子表面活性劑對CEP提取的影響

圖3 非離子表面活性劑對CEP提取的影響Fig.3 Effect of nonionic surfactant type on the extraction of cellenvelope protainase

非離子表面活性劑也會促進CEP的釋放，其對疏水性物質有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，因此其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，可以使CEP的C-末端從細胞膜上脫落下來。而且非離子表面活性劑對蛋白的變性作用影響較小，其影響可以通過Sephadex LH-50除去，也可直接上DEAE-Sephadex層析分離目的蛋白，不必除去非離子表面活性劑。本實驗比較了幾種非離子表面活性劑對提取酶的影響，添加量均為體積分數(shù)0.5%，結果見圖3?？梢娞砑覶ween-20更有利于CEP的釋放。

2.2.1.4 Tween-20添加量對CEP提取的影響

Tween-20有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力，且相對于其他類型的Tween要更溫和一些，其添加量對提取CEP的影響見圖4。可見，Tween-20的添加量在達到2%時酶活力已經(jīng)趨于平衡了。

圖4 Tween-20添加量對CEP提取的影響Fig.4 Effect of Tween-20 concentration on the extraction of cellenvelope protainase

2.2.1.5 NaCl濃度對CEP提取的影響

圖5 NaCl濃度對CEP提取的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on the extraction of cell-envelope protainase

少量離子的作用，可以減少蛋白質分子極性基團之間的靜電引力，加強蛋白質與提取液之間的相互作用，從而促進溶解[15]。由圖5可見，NaCl濃度達到150mmol/L時，CEP的提取效果更顯著。

2.2.1.6 pH值對CEP提取的影響

提取液的pH值應在酶的穩(wěn)定pH值范圍內(nèi)，并應遠離其等電點的pH值，使蛋白質分子帶上凈電荷，以增大其溶解度[15]。從文獻[13]查得CEP的pI值為4.5，且根據(jù)前人用溶菌酶法提取CEP的經(jīng)驗，本實驗選用8.0、8.5、8.9進行正交試驗，比較不同pH值對CEP提取的影響。

2.2.1.7 裂解液成分的正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗結果基礎上，確定了裂解液成分正交試驗的幾種考察因素及水平，以酶比活力(酶比活力=酶活力/蛋白質含量)為指標，結果見表2。

表2 裂解液成分的正交試驗結果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing the composition and pH of cell lysis solution

綜合分析表2可知，A、B、C、D四因素中，因素B、A是最重要的，且都是第3水平最優(yōu)，這反映出非離子表面活性劑(Tween-20)和溶菌酶是裂解液最關鍵的兩個因素，另外兩個因素的影響相對小一些。以酶比活力為指標，得出裂解液影響CEP提取的程度大小順序為Tween-20添加量＞溶菌酶＞pH值＞NaCl，極差分析得出最優(yōu)水平組合是A3B3C2D3，而9個試驗組中最佳組合條件為A3B3C2D1，經(jīng)驗證A3B3C2D3組合條件下所得酶比活力為26.438U/mg，效果更好。因此，確定提取發(fā)酵乳桿菌CEP的裂解液成分為：50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9。

2.2.2 CEP提取條件的優(yōu)化

2.2.2.1 裂解液與菌體的比例

圖6 裂解液與菌體的比例對CEP提取的影響Fig.6 Effect of cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio on the extraction of cell-envelope protainase

由圖6可知，在裂解液與菌體的比例在10:1時，CEP的酶比活力達到最大。

2.2.2.2 保溫時間

圖7 保溫時間對細胞壁蛋白酶提取的影響Fig.7 Effect of incubation time on the extraction of cell-envelope protainase

由圖7可知，隨著保溫時間的延長，CEP蛋白酶活力基本呈增大趨勢，4.5h時蛋白酶活力達到最大。

2.2.2.3 保溫溫度

圖8 保溫溫度對CEP提取的影響Fig.8 Effect of incubation temperature on the extraction of cellenvelope protainase

由圖8可知，隨著溫度的上升，酶活力、蛋白質含量、酶比活力都呈增大趨勢，當保溫溫度為41℃時，蛋白質釋放量基本趨于平衡，酶活力和酶比活力都達到最大值。

2.2.2.4 提取條件正交試驗的優(yōu)化

在單因素試驗結果基礎上，確定了提取條件正交試驗的幾種考察因素及水平，以酶比活力為指標，結果見表3。

從表3的極差可以看出，各個因素影響CEP提取的大小順序為裂解液與菌體的比例＞保溫時間＞保溫溫度，通過直觀分析得出最優(yōu)水平組合是A2B3C1，而9個試驗組中最佳組合也為A2B3C1。因此，確定提取發(fā)酵乳桿菌CEP的提取條件為：裂解液與菌體的比例10:1、保溫時間5h、保溫溫度37℃，在該條件下所得酶比活力為38.957U/mg。

表3 提取條件正交試驗結果Table 3 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing three extraction conditions

3 結 論

本實驗確定了從發(fā)酵乳桿菌中提取CEP的方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、體積分數(shù)3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9)懸浮菌體(10:1)，37℃保溫5h，于4℃、4500r/min離心20min后取上清液即為粗酶液。本實驗確立了溶菌酶結合非離子表面活性劑法提取發(fā)酵乳桿菌CEP的基本實驗路線，方法簡便，所得酶活力也較高。關于發(fā)酵乳桿菌細胞壁蛋白酶的酶學性質、結構及特性還有待于進一步研究。

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Extraction of Cell-envelope Proteinase from Lactobacillus fermentum

ZHU Xu1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch of National Dairy Products Processing Technology Developing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Lysozyme treatment was selected out of three commonly used ways for extracting cell-envelope protainase from Lactobacillus fermentum cells in the present study. The composition and pH of cell lysis solution and three extraction conditions were optimized using orthogonal array design. The best cell lysis solution was a mixture of 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 3% Tween-20 and 2 mg/mL lysozyme at pH 8.9. Cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio of 10:1 (V/m) and incubation time of 5 h at a constant temperature of 37 ℃ were found optimal for the extraction of cell-envelope protainase, and the maximum specific enzyme activity was up to 38.957 U/mg under these conditions.

Lactobacillus fermentum；cell-envelope proteinase；extraction

TS201.3

A

1002-6630(2010)19-0268-05

2010-01-28

朱姁(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。E-mail：jsdfzhuxu@hotmail.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：daodongpan@126.com