李紅霞，呂敬軍，陸豐升，于麗娜，王世清，楊慶利,*，畢 潔，孫 杰，張初署

黑曲霉固態(tài)發(fā)酵花生殼提取水溶性膳食纖維

李紅霞1,2，呂敬軍3，陸豐升4，于麗娜2，王世清1，楊慶利2,*，畢 潔2，孫 杰2，張初署2

(1.青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100；3.臨沂市農業(yè)委員會，山東 臨沂 276000；4.沂水縣林業(yè)局，山東 沂水 276400)

以花生殼為原料，應用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備花生殼水溶性膳食纖維。通過對黑曲霉菌株特性及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究，確定培養(yǎng)溫度、菌齡、接種量、培養(yǎng)時間的最佳水平，響應面輔助法獲得花生殼水溶性膳食纖維的最佳提取工藝條件為：以8g花生殼為原料，水1.88mL/g原料，(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO4 5.63g/100mL的優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度27℃、黑曲霉菌齡2.9d、接種量16mL、培養(yǎng)時間9.1d，黑曲霉發(fā)酵液水解花生殼酶解率可以達到11.03%，水溶性膳食纖維中已糖的聚合度為152.71%，綜合評分為105.48。

水溶性膳食纖維；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵；提取

譽為第七大營養(yǎng)素的膳食纖維(dietary fiber，DF)按溶解性分為水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)兩大類[1]。其中水溶性膳食纖維(SDF)是指可溶于溫、熱水且其水溶液又能被其4倍體積的乙醇再沉淀的，但不被人體消化道酶消化的那部分膳食纖維[2]。跟水不溶性膳食纖維(IDF)比較，SDF在預防結腸癌，預防心血管疾病，降低膽固醇等方面具有更強的生理功能[3-4]，SDF還能刺激產生胰島素，降低血脂含量、延緩小腸對葡萄糖的吸收速度，從而預防糖尿病的發(fā)生[5]。水溶性膳食纖維作為一種多功能保健性食品基料，早已引起世界各國營養(yǎng)學家的極大關注。

我國是世界花生生產、消費和出口大國，花生總產量和出口量均居世界前列。在花生加工過程中，花生殼是花生加工的下腳料[6]?；ㄉ鷼じ缓w維素、半纖維素和木質素等粗纖維，是天然膳食纖維很好的來源。近年來，有關提取膳食纖維的報道不少[7-12]，但未見利用黑曲霉法從花生殼中提取膳食纖維的報道。而微生物發(fā)酵產酶進行提取功能性物質已成一種趨勢，微生物固態(tài)發(fā)酵具有設備投資少、操作成本低，可使用農副產品作原料、易推廣等優(yōu)點。而黑曲霉屬于絲狀真菌，適合采用固態(tài)發(fā)酵的方式，且是國際上公認的可用于食品的安全菌株[13-16]，因此本實驗以黑曲霉為菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方法產SDF，旨在為水溶性膳食纖維的制備和花生殼的變廢為寶提供新途徑，同時促進花生加工副產品的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料

花生殼為山東省花生研究所萊西實驗站2008年9月收獲的花育19品種，挑選無霉爛和蟲蛀的花生殼，清水洗凈，烘箱中80℃干燥，植物粉碎機粉碎，過50目篩，取篩下物作為實驗用原料。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉(Aspergillus niger 30786)，由中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯20、葡萄糖2、瓊脂2；PDY培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯20、葡萄糖2、酵母膏1；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(g/L)：花生殼粉8g、15mL蒸餾水、(NH4)2SO41.88、KH2PO41.88、MgSO45.63。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉活化、擴大、轉代的培養(yǎng)方法

菌種活化：用無菌吸管取0.2mL菌體懸浮液，移植于PDA培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。

擴大培養(yǎng)：用接種針從活化的培養(yǎng)基上挑1環(huán)活化孢子于PDA培養(yǎng)基上，27℃溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。

種子培養(yǎng)：將擴大培養(yǎng)基上的孢子用無菌水淋洗制成懸浮液，再接入裝有100mL PDY培養(yǎng)基中，于27℃搖床150r/min振蕩培養(yǎng)3d。

1.3.2 菌株的特性

生長曲線測定：向250mL三角瓶中加入100mL PDY培養(yǎng)基，接入菌齡3d的10mL孢子懸浮液，于27℃搖床150r/min振蕩培養(yǎng)8d，每隔0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0d取樣1次，平行取3個點，測定菌體生物量，作出生長曲線。

pH值的選擇：向250mL三角瓶中加入100mL PDY培養(yǎng)基，接入菌齡3d的10mL孢子懸浮液，pH值分別設定為5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0，每個pH值取3個平行樣，于27℃搖床150r/min振蕩培養(yǎng)8d，測定菌體生物量、pH值。

1.3.3 SDF的提取

經過預處理的花生殼粉采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵法提取SDF。稱取8g的經預處理的花生殼粉滅菌后，無菌加入黑曲霉，在21～33℃條件下生長7～11d。加入75～100mL的水后，在45℃水浴中振蕩培養(yǎng)4h，抽濾，保留濾液，即發(fā)酵液。濾渣在60℃條件下干燥，稱其質量。發(fā)酵液滅菌后，真空旋轉蒸發(fā)濃縮，在濃縮液中加入4倍無水乙醇，靜置過夜，抽濾，濾液濃縮后再加4倍無水乙醇，抽濾，收集兩次沉淀溶于沸水中，離心，上清液濃縮后加4倍無水乙醇、抽濾，沉淀干燥得到由黑曲霉固態(tài)發(fā)酵花生殼粉制備的SDF。

1.3.4 發(fā)酵工藝及響應面試驗設計

在黑曲霉發(fā)酵花生殼粉制備SDF實驗中，加水量、培養(yǎng)時間、固體發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源等條件都會影響SDF的提取。因此，本研究在確定這3個因素的最佳條件之后，以溫度(A)、菌齡(B)、接種量(C)、培養(yǎng)時間(D)4個因素進行響應面試驗，以SDF中己糖的聚合度、黑曲霉發(fā)酵液水解花生殼的酶解率和綜合評分為評價指標，確定最佳工藝參數。

1.3.5 評價指標綜合評分的確定[17]

評價指標綜合評分由SDF中己糖的聚合度和黑曲霉發(fā)酵液水解花生殼的酶解率兩項結果組成，采取100分制?？紤]它們的重要程度，取權重比為己糖的聚合度:酶解率=2:1。

采用苯酚-硫酸法測定己糖質量濃度：取發(fā)酵液或發(fā)酵液水解液(發(fā)酵液加入體積分數4%硫酸在120℃條件下水解2h)2mL，加入1mL苯酚和5mL硫酸，混勻。以空白樣調零，在波長490nm處測定吸光度，根據標準曲線計算其中的己糖質量濃度。

式中：C1為發(fā)酵液中己糖的質量濃度/(μg/mL)；C2為發(fā)酵液水解液中己糖的質量濃度/(μg/mL)。

式中：m1為黑曲霉發(fā)酵前花生殼粉總質量/g；m2為黑曲霉發(fā)酵后烘干的花生殼粉總質量/g。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉生長曲線

圖1 黑曲霉生長曲線Fig.1 Growth curve of Aspergillus niger

由圖1可知，在第3天黑曲霉的生物量達到最高值，6d后呈現(xiàn)明顯的衰減趨勢。由此可知，在標準PDY培養(yǎng)基中，黑曲霉生活周期為7d左右，接種后前24h，生物量并不高，屬于延遲期，24～32h處于指數生長期，第3天至第7天屬于穩(wěn)定期，7d后屬于衰亡期。穩(wěn)定期為積累菌代謝產物的重要時期，菌在這一時期將分泌多種降解酶類，隨著營養(yǎng)物質的被利用和代謝產物的積累，環(huán)境因子隨之發(fā)生改變，菌體進入衰亡期，無法繼續(xù)提供代謝產物。所以取菌齡3d的孢子懸浮液作為實驗用菌。

2.2 pH值的確定

表1 pH值對黑曲霉菌體生物量的影響Table 1 Effect of pH on Aspergillus niger biomass

由表1可知，初始pH值在6.4～6.7左右，較適合黑曲霉菌株生長，最終pH值維持在1.98左右。說明pH值對微生物的生長和代謝產物的積累有重要影響，所以用pH6.4作為試驗用pH值。

2.3 加水量的確定

經過預處理的花生殼粉8g，分別加水0、0.625、1.25、1.88、2.5、3.13mL/g原料(即0、5、10、15、20、25mL)，溫度27℃，接種量15mL，菌齡3d，培養(yǎng)時間8d，每組試驗重復3次，研究加水量對SDF提取的影響，結果見圖2。

由圖2可知，加水量對膳食纖維的含量有一定的影響，且隨著加水量的增加，SDF的酶解率和綜合評分有所增加而后減少。含水量過少時，無法滿足黑曲霉孢子萌發(fā)菌絲生長所需濕度，產酶較少；含水量過大時，濕度過大，造成培養(yǎng)基的通氣、散熱差，培養(yǎng)基易結塊成團而抑制微生物產酶[18]，考慮SDF含量，當加水量為1.88mL/g(15mL)時，SDF的相對含量達到最大，SDF的綜合評分最高。

圖2 加水量對SDF提取的影響Fig.2 Effect of water amount on SDF extraction

2.4 培養(yǎng)時間的確定

經過預處理的花生殼粉8g，加入15mL水，溫度27℃，接種量15mL，菌齡3d，培養(yǎng)時間分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16d，每組試驗重復3次，研究培養(yǎng)時間對SDF提取的影響，結果見圖3。

圖3 培養(yǎng)時間對SDF提取的影響Fig.3 Effect of Aspergillus niger fermentation period on SDF extraction

由圖3可知，在6～12d左右，產品中己糖的聚合度維持在較高水平。這與黑曲霉的生長周期基本相符，8d后菌體完成了代謝產物的積累，進入衰亡期，不能繼續(xù)降解和轉化原料中的纖維素類物質，同時菌體量減少，菌體中膳食纖維量也隨之減少，造成發(fā)酵產物中膳食纖維含量下降。

2.5 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化[19]

經過預處理的花生殼粉8g，加入15mL水，加入KH2PO4、MgSO4和(NH4)2SO4，溫度27℃，接種量15mL，菌齡3d，培養(yǎng)時間8d，每組試驗重復3次，研究培養(yǎng)基對SDF提取的影響，結果見表2。

表2 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵花生殼培養(yǎng)基條件的優(yōu)化Table 2 Results of orthogonal array optimization of medium composition for Aspergillus niger fermentation

表3 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵花生殼培養(yǎng)基優(yōu)化條件的方差分析Table 3 Variance analysis of the results of orthogonal array optimization of medium composition for Aspergillus niger fermentation

從表2、3可以看出，第3試驗組A1B3C3為最優(yōu)培養(yǎng)基優(yōu)化組合，(NH4)2SO4和KH2PO4對SDF的提取影響差異顯著(P＜0.05)。即(NH4)2SO4和KH2PO4質量濃度的大小對SDF的提取最重要，MgSO4對SDF的提取影響不大。從極差R和F值也可以看出，F(xiàn)C＞FA＞FB，說明各因素對SDF的提取影響的主次順序為C＞A＞B，即(NH4)2SO4＞KH2PO4＞MgSO4，最優(yōu)水平組合為A1B1C3，這與用極差R的判斷結果一致。由于表中沒有A1B1C3組合，必須對其進行驗證性實驗。在A1B1C3的組合條件下，酶解率8.32%，聚合度142.78%，綜合評分97.96。故確定培養(yǎng)基優(yōu)化條件為A1B1C3。即最優(yōu)培養(yǎng)基配方：花生殼粉8g、水1.88mL/g原料、(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO45.63g/100mL，在此條件下，酶解率8.32%，聚合度142.78%，綜合評分可達97.96。

2.6 響應面分析法確定重要因素的最佳水平

表4 響應面因素水平設計表Table 4 Factors and levels in the response surface design for optimizing fermentation conditions of Aspergillus niger

根據中心組合試驗設計原理，考察X1培養(yǎng)溫度、X2菌齡、X3接種量和X4培養(yǎng)時間對SDF提取(Y)的影響[20]，因素及水平見表4，結果見表5。

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Response surface design for optimizing fermentation conditions of Aspergillus niger experimental results

2.6.1 模型的建立及顯著性檢驗

對自變量編碼X1、X2、X3和X4進行回歸分析，得二次多項回歸方程為：

Y=104.39＋0.017X1－2.08X2＋2.84X3＋1.59X4＋3.14X1X2＋1.84X1X3－2.76X1X4＋40.99X2X3＋1.24X2X4＋3.20X3X4－13.18X12－7.98X22－10.01X32－8.10X42

通過Design-Expert軟件進行方差分析來驗證回歸模型及各參數的顯著性，結果見表6。

由表6方差分析可以看出，模型P值遠小于0.05，表示模型方程極顯著，模型失擬項不顯著，模型選擇適合。因此可以用該模型方程來分析和預測不同條件下SDF提取情況。方程中X3、X12、X2.2、X32、X42對Y的影響極顯著，X2、X1X2、X1X4、X3X4對Y的影響顯著，表明試驗因素對響應值的影響并非呈線性關系。通過直接比較方程中一次項系數絕對值的大小，可以判斷因素影響的主次性。對SDF提取情況影響的大小依次是接種量、菌齡、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度，即接種量對SDF提取影響最顯著，菌齡對SDF提取也較顯著。

表6 模型的方差分析結果Table 6 Variance analysis for the developed quadratic regression model based on response surface design

2.6.2 因素交互作用分析

響應面圖中一個響應曲面坡度相對平緩，表明SDF提取的綜合評分可以忍受處理條件的變異，而不影響到響應值的大小；相反，一個響應曲面非常的陡峭，表明響應值對處理條件的改變非常敏感。等高線圖表示在同一個橢圓形的區(qū)域里面，SDF提取的綜合評分是相同的。在橢圓形區(qū)域中心，SDF提取的綜合評分最好，由中心向邊緣逐漸減少。圖中橢圓排列越密集，說明該因素變化對SDF提取影響越大。同時等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著；而圓形與之相反，此時兩因素交互作用可以忽略。

圖4 培養(yǎng)溫度和菌齡交互作用對SDF提取的影響Fig.4 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation temperature and seed age on SDF extraction

由圖4可知，溫度和菌齡兩因素的交互作用顯著，溫度較低時，SDF綜合評分隨著菌齡的增加而減??；溫度較高時，SDF綜合評分隨著菌齡的增加先增加而后減少。最優(yōu)點接近于溫度為27℃，菌齡為2.9d。從等高線圖可知，該過程溫度的變化與菌齡的變化對SDF綜合評分的影響作用強弱為：菌齡的變化＞溫度的變化。

圖5 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間交互作用對SDF提取的影響Fig.5 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation temperature and period on SDF extraction

由圖5可知，溫度和培養(yǎng)時間兩因素的交互作用顯著，溫度較低時，SDF的綜合評分隨著培養(yǎng)時間的增加而減??；溫度較高時，SDF綜合評分隨著培養(yǎng)時間的增加先增加而后減少。最優(yōu)點接近于溫度為27℃，培養(yǎng)時間為9.1d。從等高線圖可知，該過程溫度的變化與培養(yǎng)時間的變化對SDF綜合評分的影響作用強弱為：培養(yǎng)時間的變化＞溫度的變化。

圖6 接種量和培養(yǎng)時間作用對SDF提取的影響Fig.6 Response surface plot illustrating the interactive effects on fermentation period and inoculum size on SDF extraction

由圖6可知，接種量和培養(yǎng)時間的交互作用顯著，接種量較少時，SDF綜合評分隨著培養(yǎng)時間的增加先增加后減少；接種量較大時，SDF綜合評分隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。最優(yōu)點接近于接種量為15mL，培養(yǎng)時間為9.1d。從等高線圖可知，該過程溫度的變化與菌齡的變化對SDF綜合評分的影響作用強弱為：接種量的變化＞培養(yǎng)時間的變化。

2.6.3 提取條件的優(yōu)化及驗證

進一步用Design-Expert軟件對試驗模型進行典型性分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經分析得，培養(yǎng)溫度26.95℃、菌齡2.89d、接種量15.77mL、培養(yǎng)時間9.12d，在此點預測的綜合評分為104.825?？紤]到試驗的實際情況，確定培養(yǎng)溫度27℃、菌齡2.9d、接種量16mL、培養(yǎng)時間9.1d，在其余培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不變的情況下，酶解率為11.03%，聚合度為152.71%，綜合評分達105.48，與預測實驗結果相差不大，說明響應面優(yōu)化工藝比較有效。

3 結 論

通過對黑曲霉菌株特性及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究，以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化確定出優(yōu)化培養(yǎng)基的成分是：花生殼粉8g、水1.88mL/g原料、(NH4)2SO41.88g/100mL、KH2PO41.88g/100mL和MgSO45.63g/100mL，利用響應面法對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵提取SDF進行了優(yōu)化。結果表明，培養(yǎng)溫度27℃、菌齡2.9d、接種量16mL、培養(yǎng)時間9.1d，在此條件下綜合評分達105.48，而制得的SDF產品為淡黃色，有清淡的糖的香味。各因素作用的主次順序為：接種量＞菌齡＞培養(yǎng)時間＞培養(yǎng)溫度。

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Optimization of Extraction of Soluble Dietary Fibre from Peanut Hull by Aspergillus niger Solid-state Fermentation

LI Hong-xia1,2，LU Jing-jun3，LU Feng-sheng4，YU Li-na2，WANG Shi-qing1，YANG Qing-li2,*，BI Jie2，SUN Jie2，ZHANG Chu-shu2
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China；3. Linyi Agriculture Committee, Linyi 276000, China；4. Yishui Forestry Bureau, Yishui 276400, China)

In order to promote the high value-added utilization of peanut hull, a byproduct of peanut processing, the solid-state fermentation of Aspergillus niger was employed to extract soluble dietary fibre (SDF) from the resource. The growth curve of Aspergillus niger in standard PDY medium was plotted for determining the optimal seed age. This was followed by optimizing the medium composition by orthogonal array design and four fermentation conditions including temperature, seed age, inoculum size and fermentation period by response surface methodology. The optimal medium composition was found to be composed of 8 g of peanut hull and 1.88-fold volume of water containing 1.88 g/100 mL (NH4)2SO4, 1.88 g/100 mL KH2PO4 and 5.63 g/100 mL MgSO4, and the optimal fermentation period and temperature, seed age and inoculum size were 9.1 days, 27 ℃, 2.9 days and 16 mL, respectively. The resultant hydrolysis efficiency, SDF polymerization degree and comprehensive score were 11.03%, 152.71% and 105.48, respectively.

water soluble dietary fiber；Aspergillus niger；solid-state fermentation；extraction

TS255.1

A

1002-6630(2010)19-0277-06

2010-06-22

國家“863”計劃項目(2007AA10Z189；2006AA10A114)；國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系專項 (nycytx-19)

李紅霞(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：yanxia-102500@163.com

*通信作者：楊慶利(1977—)，男，助理研究員，博士，研究方向為花生綜合利用與花生功能食品開發(fā)。E-mail：rice407@163.com