朱慧霞，王雅潔，鄧勝松，姚日生,*，張洪斌

繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的條件研究

朱慧霞1，王雅潔2，鄧勝松1，姚日生1,*，張洪斌1

(1.合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 合肥 230601)

研究繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)右旋糖酐酶的條件。研究碳源、氮源對繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的影響，結(jié)果表明最適合發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源、氮源分別是右旋糖酐和蛋白胨。采用正交試驗(yàn)對繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最適條件為：發(fā)酵瓶裝液量為80mL/250mL，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為5.5，培養(yǎng)溫度為28℃，在該條件下，右旋糖酐酶的酶活力為18.963U/mL。

右旋糖酐酶；繩狀青霉菌；正交試驗(yàn)

右旋糖酐酶(endodextranase，dextranase，α-D-1, 6-glucan 6-D-glucanohydrolase，EC 3.2.1.11)是專一性地裂解右旋糖酐(dextran)分子中的α-1,6-葡萄糖糖苷鍵的水解酶[1-2]。右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌[3-4]比較多，最常見的有青霉菌。右旋糖酐酶是誘導(dǎo)酶，主要的誘導(dǎo)物有：右旋糖酐、改良的底物酮基右旋糖酐和改良的產(chǎn)物異麥芽糖棕櫚酸單酯或二酯[5]。目前，右旋糖酐酶的應(yīng)用非常廣泛[6-10]，主要應(yīng)用于以下3個方面：制糖業(yè)中防止蔗糖轉(zhuǎn)化、改變口腔中的葡聚糖成分預(yù)防齲齒、分解大分子右旋糖酐生產(chǎn)藥用右旋糖酐。

有很多微生物都可以作為右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌，但在目前的研究中，最有研究價值的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌是青霉菌和擬青霉菌[11-12]，因?yàn)榍嗝咕M青霉菌所產(chǎn)生的右旋糖酐酶能耐受50℃的高溫。本研究選用繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)，對其產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為右旋糖酐酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

右旋糖酐(分子質(zhì)量約40000D) 安徽朝陽制藥廠。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)，購于廣東微生物研究所。

斜面培養(yǎng)基：普通的察氏瓊脂培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：右旋糖酐1.5g、蛋白胨0.5g、K2HPO40.4g、MgSO40.02g、KCl 0.02g、FeSO40.001g，水100mL，pH6.0～7.0，0.1MPa滅菌20min。

1.3 儀器與設(shè)備

Waters系列高效液相色譜儀(配有2414型示差折光檢測器、Breeze色譜工作站)、UltrahydrogelTM500凝膠色譜柱(7.8mm×300mm)、UltrahydrogelTM120凝膠色譜柱(7.8mm×300mm) 美國Waters公司。

1.4 菌種培養(yǎng)[5]

將菌種接入察氏平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)6～8d。發(fā)酵培養(yǎng)是在28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)。

1.5 粗酶液制備

從搖瓶中取發(fā)酵液，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾除去菌體，即得粗酶液。

1.6 右旋糖酐酶酶活力測定[13]

右旋糖酐酶的酶活是用分解底物右旋糖酐產(chǎn)生的還原糖量來表示。在40℃、0.2mol/L的醋酸緩沖液(pH5.1)中，每小時生成1mg還原糖，定義為一個酶活單位。采用3,5-二硝基水楊酸試劑法測定還原糖的量(DNS比色法)[14-15]。所有的實(shí)驗(yàn)均是重復(fù)3次取平均值進(jìn)行分析。

1.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取80℃烘至質(zhì)量恒定的分析純葡萄糖100mg，置于燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，即得1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6.2 DNS試劑的配制

甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2mL 10g/100mL氫氧化鈉溶液中，用水稀釋至69mL，在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255g酒石酸鉀鈉加到300mL 10g/100mL氫氧化鈉溶液中，再加入880mL 1g/100mL 3,5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙二液相混合即得到黃色試劑，貯于棕色瓶中，室溫放置7～10d以后使用。

1.6.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取7支20mL具塞刻度試管并編號，分別加入質(zhì)量濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，配成不同葡萄糖質(zhì)量濃度的反應(yīng)液。將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20mL并搖勻，于波長540nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)作圖即得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 發(fā)酵液中右旋糖酐酶酶活力測定

取兩支20mL具塞刻度試管，分別加入4mL含1.5g/100mL右旋糖酐的0.2mol/L醋酸緩沖溶液中(pH5.1)后置于40℃水浴保溫10min。一支加入粗酶液1mL后準(zhǔn)確反應(yīng)10min后加入DNS試劑滅活，另一支先加入DNS試劑，后加入粗酶液作為對照。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。利用酶促反應(yīng)生成的還原糖吸光度的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，計算出酶活力。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計

在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，選定各個因素的水平范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察各因素對繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的影響，以期獲得繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最適條件。

1.8 總糖測定[16]

采用蒽酮法測定。

1.9 右旋糖酐分子質(zhì)量測定

[17]檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對右旋糖酐酶酶活力的影響

圖1 培養(yǎng)時間對右旋糖酐酶酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation time on dextranase production

圖2 培養(yǎng)時間對發(fā)酵液pH值、總糖含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on pH value and total sugar content

由圖1可知，在第6天繩狀青霉菌開始產(chǎn)生右旋糖酐酶，隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活力逐漸增大，在第8天酶活力達(dá)到峰值(4.316U/mL)，但較低，從圖2可以看出，菌體生長較緩慢，這可能是由于種子液中菌濃度偏低，不利于產(chǎn)酶研究，在后面的實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)提高菌濃度。在之后的研究中繩狀青霉菌的培養(yǎng)時間就選取8d，然后將發(fā)酵液過濾除菌后制得粗酶液，測定酶活力。

2.2 培養(yǎng)基成分對右旋糖酐酶酶活力的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的碳源右旋糖酐分別更換成葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和可溶性淀粉，其他成分不變，考察不同碳源對繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同碳源的產(chǎn)酶結(jié)果Fig.3 Effect of carbon kind on dextranase production

由圖3可知，3種還原糖(葡萄糖、果糖和麥芽糖)作為碳源時均不產(chǎn)生右旋糖酐酶，說明它們不能作為繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的碳源，也進(jìn)一步驗(yàn)證了右旋糖酐酶是誘導(dǎo)酶，需要有誘導(dǎo)物的存在才會產(chǎn)生。而3種非還原糖(右旋糖酐、蔗糖和可溶性淀粉)作為碳源供菌體生長時，菌體能產(chǎn)生右旋糖酐酶但酶活力都不高，其中蔗糖作為碳源時酶活力最小，可溶性淀粉作為碳源產(chǎn)生的酶活力比右旋糖酐略小?？扇苄缘矸凼荄-葡萄糖由α-1,4糖苷鍵連接而成，與右旋糖酐結(jié)構(gòu)相似，也可誘導(dǎo)右旋糖酐酶的產(chǎn)生，但從酶的專一性考慮，最適碳源為右旋糖酐。

將發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的氮源蛋白胨分別更換成牛肉浸膏、酵母浸膏、硫酸銨和檸檬酸三銨，其他成分不變，考察不同氮源對繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同氮源的產(chǎn)酶結(jié)果Fig.4 Effect of nitrogen kind on dextranase production

由圖4可知，無機(jī)氮源(硫酸銨和檸檬酸三銨)供繩狀青霉菌生長時不產(chǎn)生右旋糖酐酶、不適合作為繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的氮源。只有3種有機(jī)氮源供菌體生長時才能產(chǎn)生右旋糖酐酶，其中以蛋白胨為氮源時產(chǎn)生的右旋糖酐酶酶活力最高，這與程秀蘭等[5]報道一致。因此，蛋白胨是繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源。

2.3 產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

為了提高繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵能力，需對其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[2]，表明發(fā)酵液初始pH值、菌種培養(yǎng)溫度以及搖瓶裝液量這3個因素對該菌產(chǎn)酶的影響比較大，故對這3個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以獲得最適的繩狀青霉菌產(chǎn)酶條件。各因素的水平設(shè)計見表1。結(jié)果見表2。

表1 產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件正交試驗(yàn)表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array desiyn layout and experimental results

由表2的極差R可知，3個因素對發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的影響程度大小為A＞B＞C，即發(fā)酵液的初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響最大，其次是反應(yīng)溫度，裝液量則相對最小。因此在以后的研究中將重點(diǎn)考察發(fā)酵液的初始pH值，把初始pH值的考察范圍擴(kuò)大些，可能會大幅度提高右旋糖酐酶的酶活力。另外，以右旋糖酐酶的酶活力為指標(biāo)進(jìn)行考察，最優(yōu)組合是A2B3C2，由于表2中沒有A2B3C2試驗(yàn)組合，故需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在A2B3C2的條件下，右旋糖酐酶的酶活力為18.963U/mL，較表2中的酶活力高，因此確定繩狀青霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最適條件為發(fā)酵液初始pH值為5.5、搖瓶裝液量為80mL/250mL，在28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 右旋糖酐分子質(zhì)量測定

圖5 右旋糖酐的HPLC圖譜Fig.5 Chromatogram of dextran

圖6 發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.6 Chromatogram of fermentation broth

利用HPLC檢測發(fā)酵液中右旋糖酐的分子質(zhì)量，可驗(yàn)證前面的研究結(jié)果。圖5是右旋糖酐的HPLC圖譜，其中右旋糖酐的洗脫體積為14.944mL，對應(yīng)的右旋糖酐分子質(zhì)量為33051D。圖6是發(fā)酵液樣品的HPLC圖譜，與圖5相比，右旋糖酐的分子質(zhì)量有所下降，洗脫體積為15.148mL，對應(yīng)的右旋糖酐分子質(zhì)量為28451D，表明產(chǎn)生了右旋糖酐酶并且已使發(fā)酵液中的右旋糖酐被降解。從圖6還可看出，發(fā)酵液中也有相對分子質(zhì)量更大的右旋糖酐生成，洗脫體積分別為11.931mL和13.547mL，對應(yīng)的右旋糖酐分子質(zhì)量分別為488798D和100724D，這表明發(fā)酵液中除生成了右旋糖酐酶之外，還有能使右旋糖酐聚合的酶生成。該結(jié)果將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中的繩狀青霉菌可以發(fā)酵產(chǎn)生右旋糖酐酶，已經(jīng)通過HPLC檢測右旋糖酐的相對分子質(zhì)量進(jìn)行了驗(yàn)證。通過研究表明：不同的碳源和氮源、發(fā)酵液初始pH值、培養(yǎng)溫度、裝液量對繩狀青霉菌產(chǎn)右旋糖酐酶有不同程度的影響。結(jié)果得出繩狀青霉菌在搖瓶培養(yǎng)時其發(fā)酵產(chǎn)酶最適碳源、氮源分別為右旋糖酐和蛋白胨，最適產(chǎn)酶條件為：裝液量為80mL/250mL，發(fā)酵液初始pH值為5.5，培養(yǎng)溫度為28℃，在該條件下，右旋糖酐酶的酶活力為18.963U/mL。

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Optimizing the Fermentation Conditions of Penicillium funiculosum for Producing Dextranase

ZHU Hui-xia1，WANG Ya-jie2，DENG Sheng-song1，YAO Ri-sheng1,*，ZHANG Hong-bin1
(1. Engineering Research Center of Bioprocess, Ministry of Education, School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Pharmacy Department, Anhui Medical College, Hefei 230601, China)

This study aimed at investigating the optimal fermentation conditions of Penicillium funiculosum for producing dextranase. The optimal carbon and nitrogen sources were dextran and peptone, respectively. The orthogonal array optimization showed that the optimal fermentation conditions of Penicillium funiculosum were as follows: the volume of the medium contained in a 250 mL Erlenmeyer flask 80 mL; medium initial pH 5.5; and fermentation temperature 28 ℃, and the resultant dextranase was 18.963 U/mL under these conditions.

dextranase；Penicillium funiculosum；orthogonal array design

Q936

A

1002-6630(2010)19-0288-04

2010-06-28

安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2008A067)

朱慧霞(1977—)，女，講師，博士研究生，主要從事生物發(fā)酵與酶工程研究。E-mail：zhx777888@163.com *通信作者：姚日生(1962—)，男，教授，博士，主要從事精細(xì)化工和藥用高分子材料研究。E-mail：yaors@163.com