郭曉娜，姚惠源

苦蕎麥蛋白質對乳腺癌細胞的增殖抑制作用

郭曉娜，姚惠源

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

采用MTT法、HE染色法、掃描電鏡法研究苦蕎麥蛋白質(TBWSP31)對人乳腺癌Bcap37細胞的增殖抑制作用。結果表明：TBWSP31對人乳腺癌細胞株Bcap37的生長有明顯的抑制作用，并且存在時間效應和劑量效應。48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL。HE染色發(fā)現細胞經樣品作用后，細胞變形，變小，細胞核固縮、裂解，細胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細胞膜包裹的凋亡小體生成。掃描電鏡下觀察細胞表面超微結構，發(fā)現細胞出現典型的凋亡形態(tài)學特征，細胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細胞體積變小，細胞膜皺縮，表面凸起，形成了大量的小泡，有的成為凋亡小體。

苦蕎麥；蛋白質；乳腺癌細胞；凋亡

癌癥給人類健康所造成巨大威脅，人們一直進行著抗腫瘤活性的天然產物的研究。我國有著豐富的生物資源，從各種生物中篩選安全、高效、低毒的天然抗腫瘤活性成分成為近年來研究的重點課題。

蛋白質、核酸同多糖并稱為最重要的三種生物大分子。近年來對蛋白質及肽類的生物活性研究已初步取得了一定進展，研究發(fā)現天然蛋白及肽類是一類重要的生物活性物質，具有多方面的生物活性，如增強免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、抗氧化等。蕎麥蛋白質不僅營養(yǎng)價值高，而且具有獨特的生理功能。如降低血液膽固醇[1-2]，阻止7,12-二甲苯蒽誘發(fā)的乳腺癌[3]，抑制1,2-二甲阱誘發(fā)的大腸癌[4]，抑制膽結石的形成[5]，抗衰老[6]等。前期研究采用體外細胞培養(yǎng)的方法從苦蕎麥水溶性蛋白組分中篩選得到了具有抗腫瘤活性的有效組分，本研究主要通過倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡對腫瘤細胞形態(tài)進行觀察，研究苦蕎麥蛋白對乳腺癌細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎粉購于四川省涼山州小雜糧粉廠。

RPMI 1640細胞培養(yǎng)基 Gibco公司；小牛血清、胰蛋白酶、Sephadex G-100 上海華美生化試劑公司；谷氨酰胺、MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoloium] Sigma公司；DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200 瑞典 Pharmacia 公司。

1.2 儀器與設備

ZOPR-52D冷凍離心機 日本Hitachi Koki公司；96孔(平底)細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板 美國Costar公司；CO2培養(yǎng)箱 Thermo公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；血球計數板 上海醫(yī)療器械有限公司；Multiskan MK3酶標儀 Thermolabsystems公司；CPD-030臨界點干燥儀、SCD-005離子濺射儀 Bal-Tec公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎麥抗腫瘤蛋白的制備

采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換色譜、Sephadex G-100凝膠過濾色譜對苦蕎麥水溶性蛋白質逐步分離純化，并結合細胞實驗，篩選出苦蕎麥蛋白TBWSP31[7]。

1.3.2 細胞培養(yǎng)[8]

RPMI 1640培養(yǎng)液用1mol/L HCl溶液或NaOH溶液調pH值至7.0～7.2，過濾除菌，用前加入10%小牛血清(FCS)，加入體積分數1%谷氨酰胺溶液(200mmol/L)，加入1mL 100U/mL的青霉素和1mL 100U/mL鏈霉素，配制成完全培養(yǎng)液。各種腫瘤細胞生長在上述完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳代至旺盛生長。

1.3.3 TBWSP31對人乳腺癌細胞株Bcap37細胞增殖抑制率及IC50測定[9]

取對數生長期的Bcap37細胞用0.25g/100mL胰蛋白酶消化，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為5× 104～8×104個/mL，將細胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再加入用完全培養(yǎng)基將樣品稀釋成不同濃度的TBWSP31溶液100μL，對照組為加入等體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并設生理鹽水對照組，每組濃度設8個復孔，將細胞培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72h。用MTT法計算TBWSP31各個濃度的增殖抑制百分率，以抑制率為縱坐標，TBWSP31濃度為橫坐標，根據回歸方程計算IC50。

1.3.4 TBWSP31對人乳腺癌細胞株Bcap37細胞生長的影響

取對數生長期的Bcap37細胞，經0.25g/100mL的胰蛋白酶消化后用含RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×104個/mL，然后將細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，將不同濃度的TBWSP31溶液0.1mL加入各培養(yǎng)孔中，每組濃度設3個復孔，對照組直接加等量RPMI 1640完全培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96h。分別取不同培養(yǎng)時間的細胞，采用苔盼蘭染色法進行活細胞計數，每組濃度的細胞數取3個復孔的平均值，并繪制細胞生長曲線。

1.3.5 HE染色觀察細胞形態(tài)結構

取對數生長期的Bcap37細胞，接種到培養(yǎng)皿中(預先放置蓋玻片)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細胞在蓋玻片上生長貼壁后，加入TBWSP31溶液，對照組不加樣品，繼續(xù)培養(yǎng)48h，小心取出蓋玻片，用PBS緩沖液漂洗1～2遍，立即用質量分數4%的多聚甲醛溶液在常溫下固定5～10min，即可染色。具體步驟：蘇木素染色5min→ 自來水洗 → 鹽酸乙醇分化→ 自來水浸泡15min → 伊紅染色2min → 常規(guī)脫水，然后置于倒置顯微鏡下拍照[10]。

1.3.6 倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)結構

取對數生長期的Bcap37細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為4×105個/mL，24h后加入TBWSP31溶液，對照組不加樣品，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并且拍照，培養(yǎng)48h后，用胰蛋白酶消化收集細胞，PBS洗滌兩次(800r/min，5min)。

細胞立即置于4℃，用體積分數2.5%戊二醛(glutaraldehyde)固定 → 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)漂洗數次 →體積分數1%四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 → 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)漂洗數次 → 30%、50%、70%乙醇梯度脫水(4℃)→ 室溫90%、100%乙醇梯度脫水 → 醋酸異戊酯過渡 → 臨界點干燥→ 離子濺射→ 掃描電鏡觀察、拍照[11]。

2 結果與分析

2.1 TBWSP31對Bcap37細胞增殖抑制率的影響

圖1 TBWSP31對Bcap37細胞增殖抑制率的回歸曲線Fig.1 Regression curves of inhibition effect of TBWSP31 against the proliferation of Bcap37 cells

通過體外抗腫瘤活性實驗可以反映TBWSP31對腫瘤細胞抑制作用的劑量效應和時間效應。TBWSP31對不同培養(yǎng)時間的Bcap37細胞增殖抑制率的影響見圖1。隨著樣品質量濃度的增大，抑制率逐漸增大，當樣品質量濃度達到100μg/mL(孔板終濃度)時，曲線趨于平緩，說明當樣品達到一定質量濃度時，繼續(xù)增大樣品質量濃度，對增殖抑制率的影響不再明顯。通過回歸方程，可以得到不同作用時間下的IC50值。作用24h時，IC50值高達528.4μg/mL，而作用48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL，這說明作用時間對Bcap37細胞的增殖抑制作用的影響非常顯著(P＜0.05)。

2.2 TBWSP31對Bcap37細胞生長的影響

圖2 TBWSP31對Bcap37細胞生長的影響Fig.2 Effect of TBWSP31 treatment on the growth curve of Bcap37 cells

生長曲線能體現腫瘤細胞在體外培養(yǎng)過程中增殖動態(tài)的變化，反應抑制作用的劑量效應和時間效應。將Bcap37細胞培養(yǎng)不同時間后計數，繪制細胞生長曲線，結果見圖2。對照組(未加樣品)在培養(yǎng)24h內，細胞由于剛貼壁，生長緩慢，培養(yǎng)24h后，細胞開始增殖旺盛，細胞數量成倍增長。加樣量為50μg/mL時，72h內細胞數量逐漸增大，與對照組相比，細胞增殖受到抑制，72h后，細胞數量迅速減少(P＜0.05)。加樣量為100μg/mL(孔板終濃度)時，72h內細胞也在緩慢生長，但是增殖幅度很小，72h后，細胞數量逐漸減少(P＜0.05)。加樣量為200μg/mL時，細胞基本上不再生長，增殖明顯受到樣品的抑制(P＜0.01)。

2.3 HE染色觀察細胞形態(tài)結構

圖3 HE染色觀察Bcap37細胞形態(tài)的變化(10×40)Fig. 3 Morphological change of Bcap37 cells due to treatment with 10 μg/mL TBWSP31 observed under an invert microscope after HE staining (10×40)

培養(yǎng)于蓋玻片上的Bcap37細胞，經過爬片生長，HE染色后倒置顯微鏡拍照，如圖3所示。對照組細胞生長致密，細胞核完整，染成均一藍色，細胞質為粉紅色。細胞經樣品作用后，呈現細胞凋亡的明顯特征，細胞變形，變小，細胞核固縮、裂解，染色質染成深藍色或藍黑色，細胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細胞膜包裹的凋亡小體生成。

2.4 TBWSP31對細胞形態(tài)的影響

2.4.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

不同質量濃度的TBWSP31對Bcap37細胞作用48h后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下拍照，觀察細胞形態(tài)變化，如圖4所示。對照組細胞呈多邊形，大小均勻，細胞表面折光性強，細胞貼壁良好，生長旺盛，細胞排列緊密，與周圍細胞連接黏附。加樣組細胞生長受到抑制，細胞變形、皺縮、變小、貼壁性不佳，折光性變差，細胞排列疏松，與周圍細胞連接黏附消失。樣品作用質量濃度為5μg/mL與10μg/mL時，細胞形態(tài)上未見太大區(qū)別，10μg/mL時圓形細胞增多，而且體積變小的懸浮細胞增多。

圖4 不同質量濃度TBWSP31對Bcap37細胞作用48h時的細胞形態(tài)(10×20)Fig.4 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with different concentrations of TBWSP31 for 48 h observed under an invert microscope (10×20)

2.4.2 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)

圖5 掃描電鏡觀察Bcap37細胞形態(tài)的變化Fig.5 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with 20 μg/mL TBWSP31 observed under a SEM

TBWSP31對Bcap37細胞作用48h后，胰蛋白酶消化收集細胞，固定后在掃描電鏡下觀察細胞表面超微結構的變化，如圖5所示。對照組細胞表面有大量的微絨毛存在(圖5A1、5A2)，細胞比較圓整。TBWSP31對Bcap37細胞作用后，細胞出現典型的凋亡形態(tài)學特征，細胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細胞體積變小，細胞膜皺縮，表面凸起，似出芽現象，形成了大量的小泡，有的小泡已經脫落，成為凋亡小體(apoptotic bodies)(圖5B1、5B2)。

3 結 論

本研究主要采用倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡對腫瘤細胞形態(tài)進行觀察，研究苦蕎麥蛋白質TBWSP31對Bcap37細胞的作用方式及作用機理：體外抗腫瘤活性實驗(MTT法)表明，TBWSP31對人乳腺癌細胞株Bcap37的生長有明顯的抑制作用，并且存在時間效應和劑量效應。48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL。HE染色發(fā)現細胞經樣品作用后，細胞變形、變小、細胞核固縮、裂解，染色質染成深藍色或藍黑色，細胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細胞膜包裹的凋亡小體生成。掃描電鏡下觀察細胞表面超微結構，發(fā)現細胞出現典型的凋亡形態(tài)學特征，細胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細胞體積變小，細胞膜皺縮，表面凸起，似出芽現象，形成了大量的小泡，有的小泡已經脫落，成為凋亡小體。

[1]KAYASHITA J, SHIMAOKA I, NASKAJOH M, et al. Consumption of buckwheat protein lowers plasma cholesterol and raises fecal neutral sterols in cholesterol-fed rats because of its low digestibility[J]. J Nutr, 1997, 127(7): 1395-1400.

[2]TOMOTAKE H, SHIMAOKA I, KAYASHITA J, et al. Stronger suppression of plasma cholesterol and enhancement of the fecal excretion of steroids by a buckwheat protein product than by a soy protein isolate in rats fed on a cholesterol-free diet[J]. Biosci Biotechol Biochem, 2001, 65 (6): 1412-1414.

[3]KAYASHITA J, SHIMAOKA I, NAKAJOH M, et al. Consumption of a buckwheat protein extract retards 7, 12-dimetylbenz(α) anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats[J]. Biosci Biotechol Biochem, 1999, 63: 1837-1839.

[4]LIU Z, ISHIKAWA W, HUANG X, et al. A buckwheat protein product suppresses 1, 2-dimethyhydrazine induced colon carcinogenesis in rats by reducing cell proliferation[J]. J Nutr, 2001, 131: 1850-1853.

[5]TOMOTAKE H, SHIMAOKA I, KAYASHITA J, et al. A buckwheat protein products suppression gallstone formation and plasma cholesterol more strongly than soy protein isolate in hamsters[J]. J Nutr, 2000, 130 (7): 1670-1674.

[6]張政, 王轉花, 劉鳳艷, 等. 苦蕎蛋白復合物的營養(yǎng)成分及其抗衰老作用的研究[J]. 營養(yǎng)學報, 1999, 21(2): 159-161.

[7]郭曉娜, 姚惠源. 苦蕎麥抗腫瘤蛋白的分離純化及結構分析[J]. 食品科學, 2007, 28(7): 462-465.

[8]程寶鸞. 動物細胞培養(yǎng)技術[M]. 廣州: 華南理工大學出版社, 2000: 131-132.

[9]VERMA M, SINGH S K, BHUSHAN S, et al. in vitro Cytotoxic potential of Polyalthia longifolia on human cancer cell lines andinduction of apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in HL-60 cells [J]. Chemico-Biological Interactions, 2008, 171: 45-56.

[10]XIAO Junxia, HUANG Guoqing. Morphological study on apoptosis Hela cells induced by soyasaponins[J]. Toxicology in Vitro, 2007, 21: 820-826.

[11]SHARMA P R, MONDHE D M. Anticancer activity of an essential oil from Cymbopogon flexuosus[J]. Chemico Biological Interactions, 2009, 179: 160-168.

Anti-proliferative Effect of Tartary Buckwheat Protein Fraction TBWSP31 on Breast Cancer Cells

GUO Xiao-na，YAO Hui-yuan
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

The inhibition effect of a protein fraction TBWSP31 prepared from tartary buckwheat as described in our previous study on the proliferation of Bcap37 cells was investigated by MTT assay, HE staining and scanning electron microscopic (SEM) observation. TBWSP31 exhibited a notable anti-tumor activity in dose- and time-dependent manners and was also sensitive to human mammary cancer cell Bcap37 with IC50values of 43.37 (48 h)μg/mL and 19.75μg/mL (72 h), respectively. After treated with TBWSP31 for 48 h, Bcap37 cells revealed typical apoptotic characteristics. The HE-stained cells exhibited visible morphological changes such as nuclear fragmentation, chromatin condensation, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies under a light microscope. The SEM observations revealed that the decrease of villus, even partial disappearance, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies.

tartary buckwheat；protein；breast cancer cells；apoptotic

TS210.1

A

1002-6630(2010)19-0317-04

2010-01-19

國家自然科學基金項目(30900999)；高等學校博士學科點專項科研基金項目(200802951003)

郭曉娜(1978—)，女，副教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：gxn1978@hotmail.com