HPLC測(cè)定腫節(jié)風(fēng)片中異秦皮啶和迷迭香酸的含量

肖小武， 李婷婷， 寧火華， 羅躍華*

(1.南昌大學(xué)藥學(xué)系，江西南昌330046;2.江西省食品藥品檢驗(yàn)所，江西南昌330029)

腫節(jié)風(fēng)片由腫節(jié)風(fēng)干浸膏加工精制而成的單方制劑，腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb)Nakai的干燥全株，二者均收載于《中國(guó)藥典》2005年版一部，具有清熱涼血，活血消斑，祛風(fēng)通絡(luò)之功效［1］。原標(biāo)準(zhǔn)以異嗪皮啶為含量測(cè)定指標(biāo)，但異嗪皮啶的抗炎活性未能得到充分的證明，黃明菊［2］等人從腫節(jié)風(fēng)浸膏中成功分離得含量較高的迷迭香酸及其它7個(gè)化合物，且現(xiàn)已證明迷迭香酸具有抗菌作用、抗炎作用、抑制血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗血栓和抗血小板聚集、還具有抗氧化、抗病毒、抗過(guò)敏等生物活性［3-4］。表明腫節(jié)風(fēng)的藥理作用和臨床適用癥與迷迭香酸的藥理作用相吻合［5］。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部標(biāo)準(zhǔn)研究課題研究的要求，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［1，6］，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定腫節(jié)風(fēng)片中異秦皮啶和迷迭香酸的含量，從而為提高腫節(jié)風(fēng)片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制其質(zhì)量提供有效的方法。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀:Aglient 1100高效液相色譜儀，紫外可變檢測(cè)器 ，Aglient 1100化學(xué)工作站。BUG25-06型超聲波清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)。對(duì)照品異秦皮啶(批號(hào):110837-200304，來(lái)源:中國(guó)藥品生物制品檢定所)和迷迭香酸(批號(hào):MW080504，來(lái)源:SIGMA-ALDRICH)。腫節(jié)風(fēng)片由江西天施康中藥股份有限公司提供。乙腈為色譜純，磷酸、甲醇均為分析純;超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為342 nm。理論板數(shù)以異秦皮啶峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，異秦皮啶和迷迭香酸的分離度大于1.5。見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照樣品溶液(A)、供試品溶液(B)、空白樣品溶液(C)HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液的制備 取異秦皮啶對(duì)照品、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含10μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取腫節(jié)風(fēng)片10片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取50 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)40 min，放冷，再精密稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液配制不同濃度進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到異秦皮啶和迷迭香酸的回歸方程分別為:Y=3 006.04 X+1.447 8 R2=0.999 99，Y=1 723.79X －4.944 1 R2=0.999 92。結(jié)果表明，異秦皮啶和迷迭香酸分別在0.011～2.214μg和0.021 2～2.198μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液(批號(hào):06121901)照2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備溶液，分別于 0、4、11、16、23、32 h 進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果異秦皮啶和迷迭香酸的RSD(n=6)分別為0.63%和0.83%。表明供試品溶液在32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液(異秦皮啶濃度:0.022 3μg/mL;迷迭香酸濃度:0.022 34μg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果異秦皮啶和迷迭香酸的RSD(n=6)分別為1.0%和1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批腫節(jié)風(fēng)片樣品(批號(hào):06121901)6份，照2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果異秦皮啶和迷迭香酸含量平均值(n=6)分別為2.77 mg/g和12.18 mg/g。RSD分別為0.80%和1.06%。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的腫節(jié)風(fēng)片樣品(批號(hào):06121901)適量，研細(xì)，取約 25 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入對(duì)照品溶液(異秦皮啶濃度為0.002 8 mg/mL迷迭香酸濃度為0.009 6 mg/mL)25 mL。進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果異秦皮啶和迷迭香酸的平均回收率(n=6)98.7%(RSD為2.22%)及96.9%(RSD為2.76%)。見(jiàn)表1、2。

表1 異秦皮啶回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定 取10批腫節(jié)風(fēng)片按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 不同提取時(shí)間的比較 試驗(yàn)中曾考察了10、15、20、30、40 min和60 min不同提取時(shí)間的比較，含量數(shù)據(jù)結(jié)果表明40 min和60 min含量測(cè)定結(jié)果基本一致，說(shuō)明超聲提取40 min已能達(dá)到效果，故確定超聲處理時(shí)間為40 min。

表2 迷迭香酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 腫節(jié)風(fēng)片中異秦皮啶和迷迭香酸的含量測(cè)定(n=2)

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)異秦皮啶和迷迭香酸在400～200 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果異秦皮啶在342.20 nm及212.00 nm處有最大吸收，迷迭香酸在328.90 nm及207.40 nm處有最大吸收。取供試品溶液和對(duì)照品溶液分別在342.0 nm與329.0 nm處測(cè)定，結(jié)果樣品在342.0 nm處分離度較好，峰雜質(zhì)少。故確定342.0 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 樣品測(cè)定 從測(cè)定的結(jié)果看，有一批的含量明顯高于其他批次樣品，可能是由于藥材受不同生長(zhǎng)環(huán)境以及該藥材干浸膏提取等方面的影響而成的，但樣品的測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍之內(nèi)。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:502.

［2］黃明菊，李妍嵐，曾光堯，等.腫節(jié)風(fēng)化學(xué)成分研究［J］.中南藥學(xué)，2007，5(5):459-461.

［3］李偉光，粱敬鈺.迷迭香酸的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(1):1-4.

［4］孫 峋，王靖超，李洪濤，等.迷迭香酸抗菌機(jī)理研究［J］.青島大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，18(4):41-44.

［5］郁建生，李英倫.草珊瑚研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(12):2390-2392.

［6］吳 良，袁干軍，蘇秋玲.高效液相色譜法測(cè)定迷迭香中迷迭香酸的含量［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，12(2):112-114.