牛云霞 王晨昱 楊愛(ài)軍 劉偉 尚麗娜 李敏 王金穗

1.蘭州大學(xué)病理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院病理科，甘肅 蘭州 730000

DKK3（dickkopf homolog 3 gene）目前被認(rèn)為是一種抑癌基因［1］，其表達(dá)的蛋白是Wnt信號(hào)通路的抑制劑。DKK3在人類的多種腫瘤組織和細(xì)胞株中表達(dá)減弱或消失，包括前列腺癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和肺癌等［2-6］。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤間質(zhì)血管表達(dá)DKK3［7］。血管性血友病因子（vWF） 是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成和釋放的大分子糖蛋白，本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)肺癌、胃癌細(xì)胞株都表達(dá)少量vWF，vWF與腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、遷移相關(guān)。 本研究利用組織芯片技術(shù)制作結(jié)直腸癌組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DKK3、vWF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，對(duì)兩者與MVD和兩者之間相關(guān)性及臨床意義進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院病理科2008年6月—2009年月期間確診的94例結(jié)直腸癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，所有標(biāo)本用10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋。其中男性56例，女性38例，男女比例為1.473∶1，年齡27～80歲，中位年齡56歲。所有病例根據(jù)2000年版WHO《Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System》［8］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分型和病理分級(jí)，歸類如下：⑴按組織學(xué)類型分，Ⅰ級(jí)，高分化管狀和乳頭狀腺癌1例；Ⅱ級(jí)，中分化腺癌68例；Ⅲ級(jí)，低分化腺癌和印戒細(xì)胞癌26例。⑵按部位分，結(jié)腸癌16例，直腸癌78例。⑶按有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分，有轉(zhuǎn)移的42例，無(wú)轉(zhuǎn)移的52例。所有患者術(shù)前均未接受化療或放射治療。另取31例結(jié)直腸癌組織5 cm以上的正常腸黏膜組織作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)直腸癌組織芯片的制備 采用組織芯片制作儀制作組織芯片，首先制作模板蠟塊，在模板上用組織陣列儀打出直徑為2 mm的孔，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色后的病理切片，對(duì)照相應(yīng)蠟塊選取典型癌組織區(qū)域，用組織微陣列儀獲取直徑為2 mm的柱形組織，放入模板蠟塊已打好的孔里，表面壓平。相鄰孔間距為1 mm，按標(biāo)本編號(hào)排列，每個(gè)組織共制作5個(gè)組織芯片蠟塊。將組織芯片蠟塊以4～6 μm厚連續(xù)切片，敷貼于用1%多聚賴氨酸溶液處理后的載玻片上，分別進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法。鼠抗人DKK3單克隆抗體（濃縮型，進(jìn)口分裝）購(gòu)自上海藍(lán)基生物有限公司；兔抗人vWF多克隆抗體（即用型，進(jìn)口分裝）、CD31單克隆抗體（即用型）、超敏 SP鼠抗兔試劑盒（即用型）、DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。操作嚴(yán)格按照超敏SP鼠抗兔試劑盒所附說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用試劑公司附贈(zèng)的陽(yáng)性片子作為陽(yáng)性對(duì)照， PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 DKK3蛋白為細(xì)胞核著色，vWF蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。于光學(xué)顯微鏡（400倍）視野下隨機(jī)選取3個(gè)有代表性的不同區(qū)域，每個(gè)視野的得分由細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積兩者計(jì)分之和來(lái)判斷。染色強(qiáng)度計(jì)分為：不染色=0，輕度染色=1，中度染色=2，強(qiáng)染色=3；染色面積計(jì)分為：無(wú)細(xì)胞染色=0，＜25%細(xì)胞染色=1，25%～50%細(xì)胞染色=2，＞50%細(xì)胞染色=3。若2種計(jì)分之和＞2，則為陽(yáng)性表達(dá)，≤2則為陰性表達(dá)。（-）為陰性，（+）為弱陽(yáng)性表達(dá)，（++）～（+++）為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

微血管密度（microvascular density，MVD）的判斷采用CD31抗單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)單位面積中的MVD可由此來(lái)衡量腫瘤血管的活躍程度。陽(yáng)性表達(dá)主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀。先在低倍光學(xué)顯微鏡下選取腫瘤微血管數(shù)量最豐富的區(qū)域，然后在400 倍視野下計(jì)數(shù)上述3個(gè)不同區(qū)域的血管數(shù)，取其平均值作為MVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)分析DKK3及vWF與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)方式、組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的相互關(guān)系。DKK3和vWF在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DKK3在結(jié)直腸癌組織及癌旁黏膜中的表達(dá) DKK3在結(jié)直腸癌細(xì)胞核中表達(dá)，大多表達(dá)減弱或缺失；而癌旁黏膜中呈陽(yáng)性表達(dá)，間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)DKK3。DKK3在結(jié)直腸癌中總的陽(yáng)性表達(dá)率為57.45%（54/94）。癌組織中DKK3的陽(yáng)性表達(dá)較正常腸黏膜組織降低或缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1，表1～2）。

2.2 vWF在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá) vWF表達(dá)位于結(jié)直腸癌細(xì)胞質(zhì)，在結(jié)直腸癌的癌旁黏膜均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。vWF在結(jié)直腸癌中總的陽(yáng)性表達(dá)率為27.66%（26/94）。vWF在癌旁黏膜與結(jié)直腸癌中的表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖1，表1～2）。

2.3 結(jié)直腸癌中DKK3，vWF蛋白的表達(dá)與MVD的關(guān)系 以CD31為標(biāo)記檢測(cè)MVD，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，DKK3和vWF的表達(dá)與MVD無(wú)相關(guān)性（P值分別為0.110和0.937，表3）。

2.4 DKK3與vWF在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性分析 94例結(jié)直腸癌患者中DKK3低表達(dá)而vWF陽(yáng)性表達(dá)的表達(dá)率為9.57%（9/94），進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示DKK3低表達(dá)和vWF高表達(dá)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.1310，P=0.2090）。

圖1 DKK3及vWF在結(jié)直腸癌和癌旁黏膜中的表達(dá)Fig.1 DKK3 and vWF expression in colorectal carcinoma and para-cancer mucosa

表1 DKK3和vWF表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between DKK3 and vWF expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(n)

表2 DKK3和vWF在結(jié)直腸癌及癌旁黏膜中的表達(dá)Tab.2 DKK3 and vWF expression in colorectal carcinoma and Para-cancer mucosa(n)

表3 DKK3，vWF與MVD的關(guān)系Tab.3 Relationship between expression of DKK3 and vWF and MVD

3 討 論

DKKs基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的編碼分泌性Wnt拮抗劑的基因家族，其成員DKK3基因與同族其他成員性質(zhì)差別較大，所有的DKK蛋白在調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的組織中有明顯的表達(dá)增加，Dickkopf（DKK）家族包括4個(gè)基因（DKK1～DKK14）和一個(gè)DKK3相關(guān)基因-soggy（sgy）或DKK1L。DKK蛋白（Dickkopf蛋白）是由255～350個(gè)氨基酸構(gòu)成的分泌性糖蛋白［9］。

盡管關(guān)于DKKs家族的報(bào)道較多，但對(duì)DKK3基因的研究尚較少，其生物學(xué)作用不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸黏膜隱窩上皮表達(dá)DKK3蛋白，這與Zitt等［10］的研究不同，但與Sato等［4］的研究結(jié)果相同；結(jié)直腸癌中DKK3表達(dá)下降或缺失，DKK3的表達(dá)與患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)：分化越低，沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DKK3表達(dá)就越低、甚至缺失，這些說(shuō)明DKK3基因可能是一個(gè)抑癌基因，能夠抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；同時(shí)腫瘤間質(zhì)血管不表達(dá)DKK3蛋白，結(jié)直腸癌中DKK3的表達(dá)與MVD無(wú)相關(guān)性。而Untergasser等［7］發(fā)現(xiàn)DKK3在惡性黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤及結(jié)直腸癌等富含血管的腫瘤中，間質(zhì)血管表達(dá)DKK3，同時(shí)DKK3的表達(dá)和MVD成正相關(guān)關(guān)系，能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管換的形成。本研究與Untergasser等［7］和Zitt等［10］的研究不同，這可能與本研究病例太少或DKK3在間質(zhì)血管中的表達(dá)在蛋白水平太少或沒(méi)有意義有關(guān)，是否在mRNA水平有差異，待用免疫熒光做進(jìn)一步的研究探討。St Croix等［11］曾報(bào)道檢測(cè)人類腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中基因的變異，DKK3基因就是其中之一。

本研究發(fā)現(xiàn)vWF除了由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞分泌外，結(jié)直腸癌細(xì)胞自身也可以分泌vWF，其陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，vWF的陽(yáng)性表達(dá)率高，這說(shuō)明vWF與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究先前在胃癌、肺癌細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)vWF能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移。由于vWF可在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，所以在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌中，vWF表達(dá)的增多可能緣于MVD增加，然而對(duì)94例樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)MVD與vWF表達(dá)之間并無(wú)相關(guān)性。表明在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中vWF表達(dá)的增多與MVD無(wú)相關(guān)性，主要是由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。MVD和vWF表達(dá)無(wú)相關(guān)性，可能因?yàn)関WF的表達(dá)受血管類型、組織微環(huán)境等多樣因素的影響。

本研究顯示，DKK3和vWF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.1310，P=0.2090），而與MVD無(wú)相關(guān)性，可能提示兩者是在結(jié)直腸癌的不同發(fā)生發(fā)展階段起作用。由此可見(jiàn)，DKK3低表達(dá)和vWF高表達(dá)在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中有重要作用，提示可能是一種治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。

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