黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠的作用及其機(jī)理研究

白 赟 ，李艷彥 ，高 麗 ，王永輝 ，周 然

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065； 2.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024）

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》，是一首既振奮陽氣、溫運(yùn)血行，又調(diào)暢營衛(wèi)的代表方劑，其主治病證的病機(jī)在于陽氣不足，寒邪凝滯，血行不暢。實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芪桂枝五物湯對于凍瘡模型有很好的治療作用［1］，根據(jù)黃芪桂枝五物湯的功效及所治病證的病機(jī)，如在凍傷模型基礎(chǔ)之上復(fù)加氣虛因素，則與黃芪桂枝五物湯所治病證從理論上來說更加吻合。所以本課題擬建立氣虛凍傷模型，并研究黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型的治療作用及其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠30只，雌雄兼有，體重（230±10）g，動物合格證號為 SCXK（京）2004-0002，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。所有動物提前1 w購入，分籠飼養(yǎng)，5只/籠。光照節(jié)律 12L∶12D（6∶00～18∶00），室溫（19±2）℃，室內(nèi)保持安靜。

1.1.2 試劑與儀器 TXB2、6-k-PGF1α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，均購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所（批號：20060725）。DC-2006低溫恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司），Spectramax190連續(xù)光譜酶標(biāo)儀 （美國分子儀器公司），SA-6000血流變檢測儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芪桂枝五物湯由黃芪9 g，芍藥 9 g，桂枝 9 g，生姜 18 g，大棗 3枚組成，藥材購自山西省藥材公司，經(jīng)鑒定均為正品。本藥物按原書方中諸藥用量比例，采用傳統(tǒng)水煎濃縮干燥法制成顆粒劑（由山東大洋制藥有限公司加工），每克顆粒劑相當(dāng)于生藥材劑量6.9 g，配制后含生藥材濃度為0.375 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將30只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、氣虛凍傷模型組、黃芪桂枝五物湯組3組，每組10只。除正常對照組外，其余兩組均制備氣虛凍傷模型。氣虛凍傷模型為在氣虛模型基礎(chǔ)上復(fù)加了凍傷的因素。氣虛模型采用過度疲勞聯(lián)合飲食失節(jié)的方法。實(shí)驗(yàn)前將動物進(jìn)行預(yù)游泳，剔除游泳時(shí)間少于10 min、大于20 min的大鼠。合格造模大鼠于每天上午10∶00置于盛有溫水 （22±1）℃的大塑料桶中游泳 10 min，隔日喂食（隔日禁食，隔日足量給食），連續(xù)2 w。接著再按凍傷模型的制備方法進(jìn)行［1］，將除正常對照組以外的大鼠四肢置于800 mL水和400 mL無水乙醇混合的-2℃的低溫恒溫槽內(nèi)，冷凍1.5 min后取出，1次即造模成功。正常對照組動物不施加任何刺激，自然飼養(yǎng)。造模后第2天，各組動物開始給藥，黃芪桂枝五物湯組按相當(dāng)于生藥材4.7 g/（kg·d）體重給予灌胃，正常對照組和氣虛凍傷模型組給予等量蒸餾水，每日2次。

1.2.2 檢測指標(biāo) 給藥3 d后，各組大鼠用20%烏拉坦100 mg/kg體重腹腔注射麻醉后，下腔靜脈取血5 mL，取2 mL肝素抗凝，用SA-6000血流變檢測儀檢測全血黏度、血漿黏度、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞變形指數(shù)等指標(biāo)；剩余血液3 000 rpm/min離心15 min，分離血清，照Elisa試劑盒說明書操作，檢測大鼠TXB2和6-k-PGF1α含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響

結(jié)果見表1。

表1 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響 （±s）

表1 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與氣虛凍傷模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

1 200正常對照組 52.19±9.12 3.79±0.67 1.66±0.0.37 0.39±0.03 6.23±0.68 1.54±0.39氣虛凍傷模型組 83.25±21.031）7.23±1.561）3.24±1.251） 0.42±0.06 10.28±1.231）0.83±0.141）黃芪桂枝五物湯組 66.83±13.403）5.06±0.992）1.82±0.433） 0.39±0.03 7.83±0.593）1.12±0.203）組別 全血黏度切變率（mPa·s）血漿黏度（mPa·s）紅細(xì)胞壓積（L/L）紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞變形指數(shù)

由表1可以看出，造模后第3天，與正常對照組比較，氣虛凍傷模型組大鼠全血黏度（高切、低切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高（P<0.01），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低（P<0.01）；與氣虛凍傷模型組比較，黃芪桂枝五物湯組大鼠全血黏度 （低切、高切）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著降低（P<0.05，P<0.01），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著升高（P<0.01）。

2.2 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α 的影響

結(jié)果見表2。

表2 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α的影響 （±s）

表2 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與氣虛凍傷模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

組別 n正常對照組 10氣虛凍傷模型組 10黃芪桂枝五物湯組 10 TXB2（pg/mL）6-k-PGF1α（pg/mL）192.38±29.67 5.27±1.09 359.68±44.601） 2.45±0.261）251.83±65.353） 3.65±0.872）

由表2可以看出，造模后第3天，與正常對照組比較，氣虛凍傷模型組6-k-PGF1α顯著降低 （P<0.01），TXB2顯著升高（P<0.01）；與氣虛凍傷模型組比較，黃芪桂枝五物湯組6-k-PGF1α的水平顯著升高（P<0.05），TXB2顯著降低（P<0.01）。

3 討 論

凍傷是由寒冷所致的末梢部局限性炎癥性皮膚病，主要癥狀是手指、足趾、足緣、耳廓處，因受寒冷刺激，出現(xiàn)紫紅色水腫性紅斑，邊界不清，邊緣常呈鮮紅色，壓之褪色、遇熱劇癢。嚴(yán)重者在紅斑的基礎(chǔ)上伴有水皰，糜爛或潰瘍。中醫(yī)理論認(rèn)為，凍傷乃皮膚肌肉受寒邪侵襲，經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血運(yùn)行不暢，血凝氣滯，肌膚失養(yǎng)所致。氣虛凍傷為在氣虛基礎(chǔ)上復(fù)加凍傷因素，而黃芪桂枝五物湯證的病機(jī)在于陽氣不足，寒邪凝滯，血行不暢，與氣虛凍傷的病機(jī)較吻合。

3.1 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠血流變的影響

血液作為一種含有血細(xì)胞的懸浮液體系統(tǒng)，其流變性特性首先表現(xiàn)為具有一定的流動性和變形性。血流變的異常，將會引起機(jī)體血液循環(huán)障礙，其中尤以血液黏度為重要因素。血液黏度是衡量血流變的重要指標(biāo)，血液黏度的低與高反映血液運(yùn)輸?shù)膬?yōu)與劣或血液供應(yīng)的多與少。血液黏度愈高，循環(huán)阻力越高，血液流動性愈差。血液黏度異常增加可引起血液循環(huán)及微循環(huán)障礙，尤其是微循環(huán)灌流量下降，這必然會導(dǎo)致器官和組織缺血缺氧，影響組織的代謝和功能，從而產(chǎn)生疾病。全血黏度是反應(yīng)血液流變學(xué)基本特性的指標(biāo)，涉及到血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集性和變形性、血小板聚集性等多種因素。通常認(rèn)為，高切變率下全血黏度的升高主要是由于紅細(xì)胞變形能力減低所致，低切變率下全血黏度的升高主要是由于紅細(xì)胞聚集增加所致［2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模3 d后，氣虛凍傷模型大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著性升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著性降低。說明局部皮膚凍傷后引起了血液黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)的增加，使紅細(xì)胞變形能力降低。由于這些改變，使循環(huán)阻力加大，血流減慢，造成微循環(huán)灌流障礙，使組織出現(xiàn)缺血、缺氧而壞死。而黃芪桂枝五物湯能顯著降低氣虛凍傷模型全血黏度、血漿黏度紅細(xì)胞聚集指數(shù)，顯著升高紅細(xì)胞變形指數(shù)。說明黃芪桂枝五物湯對于氣虛凍傷模型在血流變方面均有一定的改善作用。

3.2 黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷模型大鼠TXB2、6-k-PGF1α 的影響

凍傷后血液循環(huán)障礙、血栓形成是造成組織損傷的主要原因，不同程度凍傷伴隨不同程度的凝血系統(tǒng)變化。TXA2不僅是很強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，也是一種引起血小板集聚的因子；而PGI2有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管及抑制血小板積聚的作用。生理狀態(tài)下，TXA2和PGI2二者保持一定的比例，成為維持血液循環(huán)穩(wěn)定的重要因素，在維持血管正常張力、血流量調(diào)節(jié)和組織灌注等方面起著重要作用［3］。PGI2分泌減少，TXA2增多，可導(dǎo)致血管痙攣加重，血栓形成加速，后者又可繼發(fā)性地激活血小板，催化釋放腎上腺素，反饋加速血小板聚集和血栓形成［4］，被認(rèn)為是中醫(yī)血瘀證病理的重要環(huán)節(jié)［5］。由于TXA2和PGI2半衰期極短，迅速分解為性質(zhì)穩(wěn)定的TXB2和6-k-PGF1α，通常通過測定血漿中TXB2和6-k-PGF1α水平來了解TXA2和PGI2的狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氣虛凍傷模型中6-k-PGF1α顯著降低，TXB2顯著升高，說明氣虛凍傷會引起血管收縮，血小板聚集，血栓形成。黃芪桂枝五物湯能顯著升高氣虛凍傷模型6-k-PGF1α的水平，顯著降低TXB2。說明黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷的作用機(jī)理可能是通過調(diào)節(jié)TXB2和6-k-PGF1α之間的平衡。中醫(yī)理論認(rèn)為氣能行血，血的運(yùn)行離不開氣的推動作用，氣虛可使血行不暢而致血瘀，甚至瘀阻不行。黃芪是中醫(yī)補(bǔ)氣之要藥，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，提高免疫的作用［6］。且實(shí)驗(yàn)研究證明黃芪桂枝五物湯具有抗炎鎮(zhèn)痛作用［7］。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，黃芪桂枝五物湯對氣虛凍傷大鼠的治療作用，其可能的機(jī)理為通過對血循環(huán)的影響而達(dá)到益氣活血療傷的目的。

［1］李艷彥，王永輝，張永剛，等.黃芪桂枝五物湯不同給藥途徑對凍傷模型大鼠的影響及其作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2010，8（2）：181-185.

［2］王鴻儒.血液流變學(xué)［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：19-33.

［3］李麟仙.前列腺素在腦血管疾病發(fā)病中的作用［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1986，17（2）：118-123.

［4］鄭小偉.中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動物方法學(xué)［M］.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，1999.

［5］周永昌，翁心植.TXA2-PGI2的平衡與臨床［J］.中華內(nèi)科雜志，1987，26（1）：49.

［6］劉玉蓮，楊叢忠.黃芪藥理作用概述［J］.中國藥業(yè)，2004，13（10）：79.

［7］黃兆勝，施旭光，朱偉，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮(zhèn)痛的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（2）：93-96.