李偉杰,趙 耘,杜昕波,康 凱,陳 敏

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100086)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是具有異質(zhì)性特征的病原菌亞種群,常引起牛、豬、雞、兔等家養(yǎng)動物和野生動物以敗血癥及呼吸系統(tǒng)疾患為主的疾病[1-2]。目前認為不同菌株之間在宿主親嗜性、致病力、碳水化合物發(fā)酵、菌落形態(tài)和抗原特異性等方面具有明顯差異[1,3]。由于莢膜血清型決定病原菌的免疫原性,各血清型之間交叉免疫保護性較低,對該致病菌進行莢膜分型就顯得尤為重要[1]。1984年Carter G R等[2]提出多殺性巴氏桿菌血清型的標準定名,分為A、B、D、E和F 5個莢膜血清型。T ownsend K M等[4]研究表明,KMT1基因是Pm種特異性的片段。而莢膜生物合成位點hyaD-hyaC 、bcbD 、dcbF 、ecbJ 、fcbD 分別是 A 、B、D 、E、F血清型高度特異性的基因[3]。本試驗擬對上述特定的基因序列選擇不同引物進行擴增,研究多殺性巴氏桿菌種的鑒定和莢膜分型,以及與Biolog鑒定和傳統(tǒng)血凝抑制試驗的符合率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多殺性巴氏桿菌參考菌株CVCC390(A 型)、CVCC391(B 型)、CVCC392(D 型)、CVCC393(E型)、CVCC395(F型)和多殺性巴氏桿菌 C44-2 、C44-10、C44-18、C44-44 、C44-49、C45-11、C46-11、C47-5、C48-3均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室提供;支氣管敗血波氏桿菌CVCC2999、胸膜肺炎放線桿菌CVCC266、大腸埃希菌CVCC244、豬鏈球菌CVCC606、糞腸球菌A20由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要儀器及試劑 三洋CO2培養(yǎng)箱,Biolog細菌鑒定儀,Eppendorf PCR儀,北京六一電泳槽,Wealtec Dolphin-chemi凝膠成像系統(tǒng),上海精宏隔水式培養(yǎng)箱;Taq DNA聚合酶,10×PCR buffer,dNTP,DNA Marker DL 2 000和瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司;染料Goodview購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將凍干保存的多殺性巴氏桿菌用馬丁湯溶解后,接種改良馬丁瓊脂斜面(含40 mL/L馬血清和1 g/L血紅素),37℃過夜培養(yǎng);支氣管敗血波氏桿菌、豬鏈球菌用馬丁湯溶解,接種血瓊脂斜面,37℃過夜培養(yǎng);大腸埃希菌、糞腸球菌用普通肉湯溶解,接種普通瓊脂斜面,37℃過夜培養(yǎng);胸膜肺炎放線桿菌用TSB(含80 mL/L小牛血清和0.2 g/L NAD)溶解,接種 TSA(含 80 mL/L小牛血清和0.2 g/L NAD)斜面,體積分數(shù)為5%CO2環(huán)境中37℃過夜培養(yǎng)。取各菌種的斜面培養(yǎng)物劃線接種相應(yīng)的平板,37℃培養(yǎng)24 h,單菌落直接作為PCR反應(yīng)的模板進行菌落PCR。

1.2.2 菌株的Biolog鑒定 Biolog鑒定操作見參照文獻[5]。

1.2.3 菌株的Carter氏間接血球凝集試驗 參照文獻[6]用熱處理法制備莢膜抗原,并制備10 mL/L致敏血球,利用Carter氏間接血球凝集試驗檢測莢膜抗原的類型。

1.2.4 PCR引物合成 參考文獻[3-4]報道,由上海Invitrogen公司合成Pm種和型特異性引物序列,將各引物濃度稀釋至25 μ mol/L,置-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物的序列、位置及擴增片段大小見表1。

表1 引物的序列與位置Table 1 The sequence and position of primer

1.2.5 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μ L,依次加入10×PCR 緩沖液(含 25 mmol/L MgCl2)5 μ L、6 對引物(25 μ mol/L)各 1 μ L 、dNT P(2.5 μ mol/L)4 μ L 、Taq 酶(5 U/μ L)1 μ L 、雙蒸水 28 μ L,用微量可調(diào)移液器的槍頭挑取培養(yǎng)24 h的多殺性巴氏桿菌的單菌落,懸浮于PCR反應(yīng)液中。PCR反應(yīng)條件為95℃5 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃45 s,共30個循環(huán);最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 特異性檢測 取動物鼻腔和肺組織中常見的支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌、豬鏈球菌和糞腸球菌,按上述方法進行PCR擴增,檢測不同細菌種間PCR擴增的特異性。

2 結(jié)果

2.1 菌株的Biolog鑒定結(jié)果

14株菌株的Biolog鑒定結(jié)果表明,與多殺性巴氏桿菌的匹配程度最高,具體參數(shù)見表2。其中相似性(SIM)和位距(DIS)是2個重要的參數(shù),表示測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)的匹配程度。當SIM＞0.75,DIS＜5.0時,為良好的匹配;SIM 值越接近于1,鑒定結(jié)果的可靠性越強。通常在SIM值≥0.5時,就可以確定菌株的分類地位,從表2中可以看出這14株菌株均為多殺性巴氏桿菌。

表2 14株菌株的Biolog鑒定結(jié)果Table 2 The Biolog identification results of fourteen strains

2.2 菌株的Carter氏間接血球凝集試驗結(jié)果

Carter氏間接血球凝集試驗結(jié)果表明,CVCC390、C44-10、C44-18、C44-44、C48-3 為莢膜血清 A 型 ;CVCC391、C44-2、C45-11、C46-11、C47-5 為莢膜血清B型;CVCC392、C44-49為莢膜血清D型;CVCC393為莢膜血清E型;CVCC395為莢膜血清F型。

2.3 多殺性巴氏桿菌種和型特異性PCR結(jié)果

14株多殺性巴氏桿菌經(jīng)Pm種引物進行PCR擴增,均擴增出 460 bp左右的DNA片段(圖1),與預(yù)期設(shè)計的長度464 bp相符。而支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌和糞腸球菌未擴增出相應(yīng)片段。

14株多殺性巴氏桿菌經(jīng)Pm型引物進行PCR擴增,結(jié)果見圖1。菌株CVCC390、C44-10、C44-18、C44-44、C48-3擴增出1 000 bp左右的DNA片段,為莢膜血清 A 型;菌株 CVCC391、C44-2、C45-11、C46-11、C47-5擴增出760 bp左右的 DNA片段,為莢膜血清 B型;菌株 CVCC392、C44-49擴增出660 bp左右的 DNA片段,為莢膜血清 D型;菌株393擴增出510 bp左右的DNA片段,為莢膜血清E型;菌株395擴增出850 bp左右的DNA片段,為莢膜血清F型。PCR結(jié)果與Carter氏間接血球凝集試驗結(jié)果完全相符。而支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌、豬鏈球菌和糞腸球菌均未擴增出相應(yīng)的片段。

圖1 菌株多重PCR結(jié)果Fig.1 The multiplex PCR results of strains

3 討論

多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型主要為A、B和D型。近年來采用核磁共振研究證實,A型菌株的莢膜成分是透明質(zhì)酸[7],B型菌株的莢膜成分由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成[2],D型菌株的莢膜成分含有肝素[8],F型菌株的莢膜成分含有軟骨素[8-9],而E型菌株的莢膜成分至今還未搞清楚[2]。

本研究采用Pm種和型的特異性引物對多殺性巴氏桿菌參考菌株CVCC390(A型)、CVCC391(B型)、CVCC392(D 型)、CVCC393(E 型)、CVCC395(F型)和多殺性巴氏桿菌C44-2(B型)、C44-10(A型)、C44-18(A 型)、C44-44(A 型)、C44-49(D 型)、C45-11(B 型)、C46-11(B 型)、C47-5(B 型)、C48-3(A型)進行了擴增,與Biolog鑒定結(jié)果和Carter氏間接血球凝集試驗結(jié)果相一致。同時對動物鼻腔和肺組織中常見的支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌、豬鏈球菌和糞腸球菌進行擴增,均為陰性,說明引物具有很強的特異性。

多殺性巴氏桿菌種和型多重PCR技術(shù)的建立,與傳統(tǒng)的Carter氏間接血球凝集試驗相比,縮短了鑒定時間,降低了工作難度。直接以菌落為模板進行菌落多重PCR,這與水浴煮沸法、SDS-蛋白酶K裂解法等相比,也節(jié)省了大量時間[10-11]。本方法的建立對于多殺性巴氏桿菌病的早期快速診斷,并及時防治以減少經(jīng)濟損失具有重要意義。

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