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      果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02發(fā)酵條件的研究

      2010-09-25 12:36:40平文祥葛菁萍凌宏志
      關(guān)鍵詞:果膠酶果膠發(fā)酵液

      平文祥,趙 丹,宋 剛,葛菁萍,凌宏志

      (黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150080)

      亞麻是天然紡織原料之一,亞麻纖維具有透氣性好等優(yōu)良性能,日益受到人們的喜愛(ài)。但在亞麻纖維中連接著大量的粘性物質(zhì)(如果膠等),為提取其中的可紡纖維,必須在一定程度上破壞它們的連接,即進(jìn)行亞麻原莖脫膠。亞麻原莖脫膠的方法很多,主要有厭氧溫水浸漬法和雨露法。雨露法受氣候、降雨量和光照等條件的影響,多被西歐國(guó)家所采用。我國(guó)和前蘇聯(lián)主要采用的是溫水浸漬法,俗稱“漚麻”[1-2],此法是利用麻莖及水源中微生物的自然發(fā)酵作用,產(chǎn)生果膠酶,它能將果膠分解成小分子還原糖,再通過(guò)DNS法[3-4]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量,間接反映菌株分解果膠能力的大小,該法被廣泛用于生產(chǎn)。使用生物(酶)脫膠,既能減少環(huán)境污染、改善勞動(dòng)條件和減輕對(duì)纖維的損壞,又能節(jié)約能量消耗,降低成本。針對(duì)此特點(diǎn),對(duì)果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02進(jìn)行了發(fā)酵條件的初步研究和探討,并在實(shí)驗(yàn)室條件下確定其最佳培養(yǎng)方案,以期能為亞麻原莖生物(酶)脫膠的工業(yè)化生產(chǎn)服務(wù)。

      1 實(shí)驗(yàn)

      1.1 菌種來(lái)源

      果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02,由巴彥縣亞麻有限公司漚麻池中分離選育得到。

      1.2 重要試劑

      DNS試劑:將6.3g的3,5-二硝基水楊酸、262ml的2mol/lNaOH加到500ml含182g的酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加入5g苯酚及5g亞硫酸鈉,待溶解、冷卻后,加蒸餾水定容至1000ml,貯于棕色瓶中,一周后即可使用。

      1.3 培養(yǎng)基

      1)種子培養(yǎng)基:液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

      2)發(fā)酵培養(yǎng)基:果膠0.4%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,112℃滅菌30min。

      1.4 方法

      1)DNS法測(cè)定還原糖。取一定量的發(fā)酵液,6000rpm/min離心5min,再取離心上清液0.5ml移入加有0.5mlDNS試劑的試管,加4ml蒸餾水,搖勻,沸水浴中加熱5min,迅速冷卻。用分光光度計(jì)在540nm處測(cè)其吸光度值。參比液配制:離心上清液0.5ml與4.5ml蒸餾水充分混合[3]。

      2)發(fā)酵種子液的制備。以兩環(huán)的接種量將分離選育得到的菌株HDYM-02接種到種子培養(yǎng)液中,37℃靜止培養(yǎng)24h。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 溫度對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

      做溫度試驗(yàn)時(shí)采用發(fā)酵培養(yǎng)基,分別考察了在29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃時(shí),菌株分解果膠能力的大小,測(cè)定出發(fā)酵液中還原糖的含量,結(jié)果如表1所示:發(fā)酵溫度試驗(yàn)表明,溫度對(duì)本研究所篩選的菌株HDYM-02分解果膠的能力有顯著的影響。從表1可以看出,當(dāng)發(fā)酵液溫度為33℃時(shí),菌株HDYM-02產(chǎn)生的還原糖量最高,相對(duì)而言菌株繁殖也最快,;溫度過(guò)高或過(guò)低,均不利于菌株HDYM-02的自身生長(zhǎng),并且產(chǎn)生的還原糖量相對(duì)低很多,所以發(fā)酵溫度選擇33℃為宜。

      表1 溫度對(duì)菌株分解果膠能力的影響

      2.2 初始pH值對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

      采用發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行了不同初始pH值的發(fā)酵試驗(yàn),用1mol/ml的NaOH或HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的初始pH值,分別考察了初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí),菌株HDYM-02分解果膠的能力,結(jié)果如圖1,圖2所示:

      圖1發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌濃的影響圖2發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌株分解果膠能力的影響

      不同初始pH值的發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)基初始pH值不同,對(duì)菌株HDYM-02發(fā)酵分解果膠能力有顯著影響。在溫度為33℃的時(shí)候,如圖2所示,當(dāng)發(fā)酵液的初始pH值為7.0時(shí),菌株HDYM-02在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處分解果膠產(chǎn)生還原糖的量均較高,如圖1所示,此時(shí)菌株的繁殖也較快。而當(dāng)發(fā)酵液初始pH值小于7.0時(shí),產(chǎn)還原糖量有所下降,相對(duì)菌濃變化也不明顯,在發(fā)酵液初始pH值為4.5時(shí),雖然還原糖產(chǎn)量在個(gè)別幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)很高,但菌濃相對(duì)較低。所以控制發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH值為7.0時(shí)比較適宜。

      2.3 氮源對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

      在發(fā)酵培養(yǎng)基中,按照各培養(yǎng)基含氮量為0.1%,分別添加豆?jié){、(NH4)2SO4、尿素、(NH4)2CO3、NH4NO3各種氮源來(lái)代替蛋白胨,并以發(fā)酵溫度33℃,初始發(fā)酵液pH值為7.0的條件對(duì)菌株HDYM-2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果如表2所示:尿素對(duì)菌株分解果膠的能力有顯著的影響。其中,添加尿素對(duì)菌株分解果膠有利,還原糖產(chǎn)量相對(duì)較好,菌濃相對(duì)較高。另外,有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于還原糖的產(chǎn)生。

      2.4 鹽濃度對(duì)菌株HDYM-02分解果膠能力的影響

      采用發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行了不同NaCl濃度的發(fā)酵試驗(yàn),考察了NaCl濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%時(shí)的還原糖產(chǎn)量,結(jié)果如表3所示:發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)鹽濃度為0.5%~0.7%時(shí),菌株HDYM-02分解果膠能力相對(duì)較強(qiáng)。但是,各鹽濃度試驗(yàn)的還原糖產(chǎn)量差別不大,菌濃變化也不明顯,說(shuō)明鹽濃度試驗(yàn)對(duì)菌株分解果膠能力的影響不顯著。

      表2 氮源對(duì)菌株分解果膠能力的影響

      表3 鹽濃度對(duì)菌株分解果膠能力的影響

      2.5 正交試驗(yàn)

      在以上單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)發(fā)酵影響較大幾個(gè)因素,即發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH值、尿素三個(gè)因子做L9(33)正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表4。

      表4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

      連續(xù)發(fā)酵60h,試驗(yàn)結(jié)果如圖3,圖4所示。針對(duì)還原糖產(chǎn)量而言,圖4顯示:

      1)0~6h時(shí),各試驗(yàn)方案的發(fā)酵液中還原糖含量均處于上升階段,其中方案3的還原糖含量相對(duì)較少,而方案5的還原糖含量最高,其余方案產(chǎn)還原糖量介于兩者之間;

      2)6~24h時(shí),有的方案如方案8,還原糖產(chǎn)量有所下降,但總體而言仍呈上升趨勢(shì),到24h的時(shí)候,還原糖產(chǎn)量達(dá)到最大,在此階段,方案3發(fā)酵液中還原糖含量相對(duì)較低,而方案9的含量相對(duì)較高;

      3)24~48h時(shí),各實(shí)驗(yàn)方案發(fā)酵液中的還原糖含量均處于下降階段。針對(duì)還原糖產(chǎn)量下降的幅度而言,方案4下降的幅度最明顯,方案2最緩慢,其余各方案還原糖量下降幅度介于兩者之間;

      4)48~60h時(shí),發(fā)酵液中的還原糖產(chǎn)量有所上升。其中,方案9及方案2的發(fā)酵液中還原糖含量相對(duì)較高。

      綜合圖3,圖4分析,方案9發(fā)酵液中還原糖產(chǎn)量相對(duì)較高,菌株HDYM-02分解果膠的能力較強(qiáng),相對(duì)的菌濃也較高,菌株HDYM-02繁殖較快,菌體長(zhǎng)勢(shì)較好。所以,筆者認(rèn)為方案9為最佳發(fā)酵條件,最佳組合為A3B3C1,即菌株HDYM-02的最適發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵液初始pH值6.5、尿素濃度為0.5%。

      圖3 正交試驗(yàn)菌濃變化 圖4 正交試驗(yàn)還原糖量變化

      3 討論

      果膠酶屬于誘導(dǎo)酶,菌株HDYM-02必須在果膠物質(zhì)的誘導(dǎo)下才能產(chǎn)生原果膠酶,進(jìn)而將果膠分解,產(chǎn)生還原糖。菌株HDYM-2不能利用或者很少利用果膠,在發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)112℃滅菌后,果膠由于物理(如壓力、溫度等)作用而少量分解成小分子還原糖,菌種正是利用該部分的還原糖,產(chǎn)生果膠酶,此時(shí)菌株處于產(chǎn)酶階段,降解果膠生成還原糖,發(fā)酵液中還原糖含量增加。當(dāng)分解代謝產(chǎn)物即還原糖量達(dá)到一定值時(shí),該代謝物阻遏果膠酶的繼續(xù)產(chǎn)生,酶合成終止,相對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中還原糖含量也逐漸減少。隨著分解代謝物的消耗,阻遏作用被解除,果膠酶生產(chǎn)恢復(fù)正常,發(fā)酵液中的果膠被逐步分解,發(fā)酵液中還原糖量再次上升。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗,再加上菌株自身產(chǎn)酶能力的退化,使得菌種產(chǎn)酶量降低,其分解生成的還原糖量也相對(duì)減少,所以,發(fā)酵過(guò)程中雖然菌濃呈上升趨勢(shì),但產(chǎn)生的還原糖量卻始終呈波浪型分布。

      [參考文獻(xiàn)]

      [1] 于翠英,夏敬義.亞麻紡紗工藝學(xué)[M].哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社,1997.

      [2] Tang S W, Xiong HP.The present situation of the production of hemp, flax, etc. and their developmental strategies [J]. Sci&Technol Rev, 2000(3):44-46.

      [3] 顧燕松.紡織生物助劑果膠酶酶活的測(cè)定方法[J].紡織科學(xué)研究,2002(3):29-34.

      [4] 崔莉,張陳虎,錢國(guó)坻,等.果膠酶酶解產(chǎn)物DNS比色法測(cè)定條件的研究[J].印染,2002(12):32-35.

      [5] 汪甫仁,陶熙春.生物酶在前處理加工中的應(yīng)用[J].印染,2003,29(3):10-13.

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