顧陽，蔣宇,，吳輝，劉旭東，李治林，李鍵，肖晗，沈兆兵，趙靜波，楊蘊劉，姜衛(wèi)紅,，楊晟,

1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032 2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

生物丁醇制造技術(shù)現(xiàn)狀和展望

顧陽1，蔣宇1,2，吳輝1，劉旭東1，李治林1，李鍵1，肖晗1，沈兆兵2，趙靜波1，楊蘊劉1，姜衛(wèi)紅1,2，楊晟1,2

1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海 200032 2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

丁醇是大宗基礎(chǔ)化工原料，并有望成為新一代生物燃料。利用可再生原料通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇受到人們的很大關(guān)注。然而，與石油原料制造丁醇相比，目前生物丁醇的制造成本偏高。生物丁醇制造技術(shù)按重要性排序：在廉價原料替代、低丁醇濃度及存在丙酮、乙醇低值副產(chǎn)物 3個方面有改進空間。上海生物丁醇協(xié)作組設(shè)定了由易到難的技術(shù)路線圖：通過代謝工程提高丁醇比例；在丁醇高耐受菌株中導(dǎo)入和優(yōu)化丁醇合成途徑；去除葡萄糖阻遏效應(yīng)使之可利用復(fù)雜原料。協(xié)作組相信，通過與國內(nèi)外廣泛的產(chǎn)學(xué)研合作，應(yīng)可在不遠(yuǎn)的將來開發(fā)出有經(jīng)濟競爭力并可持續(xù)發(fā)展的生物丁醇生產(chǎn)工藝。

生物丁醇，生物燃料，丙丁梭菌，代謝工程

Abstract:Butanol is not only an important chemical feedstock but also expected to become a new generation biofuel.Thus,biological butanol production using renewable feedstocks has attracted renewed attention due to the worries of global oil supply and its impact on social and economic development.However, compared with petrochemical-derived butanol, biological butanol production is still not economically competition, because of its major drawbacks: high cost of the feedstocks, low butanol concentration in the fermentation broth and the co-production of low-value byproducts acetone and ethanol.Recently, Shanghai cooperative bio-butanol group(SCBG)developed a simple-to-complex technical route to improve bio-butanol production with a focus on: increasing butanol ratio in the solvent through metabolic engineering ofClostridiaspp.; introducing and optimizing the butanol synthetic pathway in the species with high butanol tolerance; overcoming the glucose repression effect to utilize low-costnon-grain based feedstocks.SCBG believes that, through extensive domestic and international industry-university-research cooperation, a sustainable and economically viable process for biological butanol production can be established in the near future.

Keywords:biobutanol, biofuel,Clostridia, metabolic engineering

丁醇既是重要的大宗化工原料，又是繼乙醇后的一種極具發(fā)展前景的新一代液體燃料，通過產(chǎn)溶劑梭菌Clostridia的厭氧發(fā)酵，可將合適的碳水化合物轉(zhuǎn)化為丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)等溶劑，此類溶劑生產(chǎn)技術(shù)因而也被簡稱為ABE發(fā)酵。

1 生物丁醇制造的歷史和現(xiàn)狀

生物法制備丁醇可追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間，以產(chǎn)溶劑梭菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的丁醇為起始原料合成丁二烯橡膠是當(dāng)時生產(chǎn)合成橡膠的最理想路線。因此，在合成橡膠大規(guī)模生產(chǎn)的同時，以玉米粉等碳水化合物為底物的溶劑發(fā)酵得到快速發(fā)展，一度發(fā)展為僅次于酒精發(fā)酵的世界第二大發(fā)酵工業(yè)。但是，從20世紀(jì)50年代開始，由于受到石油工業(yè)的沖擊，ABE發(fā)酵逐漸衰落，在歐洲、北美和日本等地逐步停止了生產(chǎn)。而中國，由于當(dāng)時特殊的經(jīng)濟和政治環(huán)境，是少數(shù)幾個仍然進行ABE發(fā)酵生產(chǎn)的國家之一。

1955年，中國第一家ABE發(fā)酵工廠——上海溶劑廠開始使用玉米發(fā)酵生產(chǎn)ABE。隨后的二、三十年間，在北京、江蘇、天津、云南、山西、浙江、河北、山東、吉林等省市，又陸續(xù)建立了約30家規(guī)模在年產(chǎn)3 000～10 000 t的ABE發(fā)酵工廠，使得國內(nèi)ABE年生產(chǎn)能力達(dá)到17萬t[1-2]。然而，隨著石油合成化工的蓬勃興起，發(fā)酵法生產(chǎn)ABE在生產(chǎn)成本上越來越?jīng)]有競爭優(yōu)勢，國內(nèi)ABE發(fā)酵企業(yè)自上世紀(jì)90年代開始逐步關(guān)閉。

近年來，隨著國際石油價格的劇烈波動以及基于石油資源不可再生性的共識，發(fā)酵法生產(chǎn)ABE技術(shù)重新引起了廣泛關(guān)注[2-3]。近幾年，國內(nèi)已有 11家ABE發(fā)酵企業(yè)建成或恢復(fù)生產(chǎn)，另有5家還在籌建中(表1)，預(yù)計投產(chǎn)后，國內(nèi)ABE發(fā)酵生產(chǎn)將達(dá)到年產(chǎn)100萬t的規(guī)模[2]。盡管2008年底的金融危機使得丁醇價格從每噸1.3萬元下跌到5 000元，丙酮從每噸 9 000元下跌到 4 000元(http://www.bioindustry.cn/info/view/13122)，迫使這些工廠停產(chǎn)，但隨著近期丁醇市場價格的回升，目前吉安生化、江蘇聯(lián)化和江蘇聯(lián)海的丁醇裝置均已復(fù)產(chǎn)，河南天冠的丁醇裝置也將于年底建成投產(chǎn)。

表1 中國ABE發(fā)酵企業(yè)[2](產(chǎn)能數(shù)據(jù)統(tǒng)計截止日期為2008年6月)Table 1 Summary of some ABE plants in China(capacity data updated to June, 2008)

梭狀芽胞桿菌Clostridia是產(chǎn)溶劑工業(yè)菌種的唯一來源，傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵中使用的工業(yè)菌種名目繁多，有關(guān)產(chǎn)溶劑梭菌的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性含糊不清，比較混亂。近年來，通過系統(tǒng)學(xué)[4-5]、基因組DNA/DNA雜交和DNA指紋圖譜[4]以及發(fā)酵性能[6]等方面的比較研究和分析認(rèn)為，工業(yè)用的產(chǎn)溶劑梭菌歸為 4個“種”(Species)，所有原來的淀粉發(fā)酵型菌株屬于單獨一個種，即丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum。該類菌呈現(xiàn)較強的淀粉酶活力，適用于發(fā)酵玉米和谷類等淀粉質(zhì)原料，同時具有獨特的系統(tǒng)發(fā)育特性，與其他3個緊密相關(guān)的種，即拜氏梭菌Clostridium beijerinckii、糖丁酸梭菌Clostridium Saccharobutylicum和糖乙酸多丁醇梭菌Clostridium saccharoperbutylacetonicum的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。已被鑒定的糖-發(fā)酵菌株大多數(shù)屬于拜氏梭菌。除了南方少數(shù)企業(yè)外，針對我國以谷、薯類為主的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)狀況，溶劑發(fā)酵菌種多為丙酮丁醇梭菌，且由國內(nèi)的研究所或工廠自行選育馴養(yǎng)而來，如中國科學(xué)院微生物研究所的AS 1.70，上海溶劑廠的具有抗噬菌體能力的新抗-2號。這些菌種所產(chǎn)溶劑中3種組分丁醇∶丙酮∶乙醇均為6∶3∶1?！捌呶濉逼陂g，中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所的焦瑞身、楊蘊劉研究員等通過土樣分離和誘變篩選獲得到了高丁醇比例菌株EA 2018，其溶劑中3種組分丁醇：丙酮：乙醇為7∶2∶1，淀粉轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)菌種高 5%[1]。此外，其他溶劑廠也結(jié)合自身特點，選育出適用于特定原料如糖蜜、水解液的菌種(表2)。

表2 中國ABE發(fā)酵所用菌種Table 2 Strains used in ABE fermentation in China

2 當(dāng)前生物丁醇制造中面臨的問題

如上所述，由于石油化工的快速發(fā)展，面對石油基丁醇的激烈競爭，ABE發(fā)酵產(chǎn)品在經(jīng)濟上處于不利地位。導(dǎo)致丁醇發(fā)酵缺乏經(jīng)濟競爭力的主要原因是：1)用作發(fā)酵的碳源成本偏高；2)發(fā)酵液中的丁醇濃度低；3)發(fā)酵過程中的丁醇選擇性不高?，F(xiàn)就這些問題分述如下：

2.1 糧食原料的高成本

傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的工藝主要包括溶劑的連續(xù)發(fā)酵、產(chǎn)物及副產(chǎn)物的蒸餾法分離提取，生產(chǎn)過程中的環(huán)境保護措施等等。目前，國內(nèi)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇的主要原料為玉米、谷物、薯干等淀粉質(zhì)糧食資源。根據(jù)2009年的文獻數(shù)據(jù)，ABE工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)1 t溶劑需要消耗玉米約4.0～4.5 t，蒸汽約13～25 t，水約 20～30 t，電約 700～100 kw·h[2]。近年來由于國內(nèi)以玉米等糧食作物為原料的生物煉制行業(yè)發(fā)展迅速，一定程度上促成了全國糧食價格的較快上升，致使生物丁醇生產(chǎn)成本大幅度增加。同時，國家出于維護糧價穩(wěn)定和糧食安全戰(zhàn)略的考慮，開始限制大規(guī)模使用玉米等糧食作物發(fā)展生物能源。因此，如何通過提高丁醇的原料轉(zhuǎn)化率和利用廉價非糧類原料生產(chǎn)丁醇來降低其生產(chǎn)成本，成為該產(chǎn)業(yè)所必須直面的瓶頸問題。

2.2 丁醇毒性造成的低產(chǎn)物濃度

傳統(tǒng)ABE發(fā)酵中生成的是三聯(lián)產(chǎn)物(丙酮、丁醇和乙醇)，提高溶劑三成分中主產(chǎn)物丁醇的濃度是降低發(fā)酵法制造丁醇成本的手段之一。據(jù)分析，如果丁醇發(fā)酵的產(chǎn)物濃度由12 g/L提高的19 g/L，產(chǎn)物分離的后續(xù)蒸餾成本將可降低一半[7]。然而，傳統(tǒng)的丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)中的丁醇終濃度維持在13～14 g/L左右，難于超過這一閾值的原因在于所生成的溶劑特別是丁醇對產(chǎn)溶劑梭菌細(xì)胞的毒害作用[8]。研究表明丁醇的親脂性使其比其他產(chǎn)物在破壞細(xì)胞膜的磷酯組分并增加膜流動性方面顯示更強的作用[9]。高濃度的丁醇嚴(yán)重破壞細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)胞膜的正常生理功能。當(dāng)丙酮丁醇梭菌的生長環(huán)境中添加 1%的丁醇時，細(xì)胞膜流動性相應(yīng)提高20%～30%[10]，由此破壞了細(xì)胞內(nèi)外的pH梯度，降低了胞內(nèi)ATP水平和影響葡萄糖的吸收，繼而抑制梭菌細(xì)胞的生長繁殖乃至殺死梭菌細(xì)胞[9]。雖然國外報道的拜氏梭菌C.beijerinckiiBA101在MP2培養(yǎng)基以及發(fā)酵調(diào)控條件下的丁醇產(chǎn)物濃度可達(dá)到20.9 g/L(總?cè)軇?2.6 g/L)，是目前報道的產(chǎn)溶劑最高的菌株[11]，但這是在特殊培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下得到的結(jié)果，還不具備工業(yè)應(yīng)用的可能。為了提高產(chǎn)溶劑梭菌本身的丁醇耐受性，Tomas等在丙酮丁醇梭菌中過表達(dá)編碼熱激蛋白的groESL基因，使丁醇對菌體細(xì)胞的抑制作用降低了85%，并最終使產(chǎn)物濃度提高了 33%[12]。Borden等在丙酮丁醇梭菌中過表達(dá)來源于基因組 DNA文庫中篩選過程中確定的2個與丁醇耐受性相關(guān)的基因，即可使重組菌體細(xì)胞的丁醇耐受水平分別提高了13%和81%[13]。上海丁醇協(xié)作組的趙靜波與俄亥俄州立大學(xué)的楊尚天等合作，利用纖維床固定化生物反應(yīng)器對丁醇生產(chǎn)菌株進行馴化，使固定在其中的菌體細(xì)胞不斷提高在產(chǎn)溶劑時期對丁醇、有機酸和自溶素等抑制物的抵抗能力，最終獲得了丁醇耐受性和丁醇產(chǎn)量均顯著提高的突變株。該菌株在P2培養(yǎng)基中發(fā)酵的丁醇終濃度可達(dá) 21 g/L。當(dāng)該突變株與纖維床反應(yīng)器固定化發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合時，在P2培養(yǎng)基中的丁醇發(fā)酵終濃度可達(dá)24～29 g/L[14]?？傮w說來，通過基因工程和代謝工程的手段雖可一定程度上提高產(chǎn)溶劑梭菌的丁醇耐受性，但這種“提高”很大程度上也受到菌株自身條件的限制。就目前工業(yè)規(guī)模的溶劑發(fā)酵而言，發(fā)酵液中的總?cè)軇┻_(dá)20 g/L時，梭菌細(xì)胞的代謝即刻停止[15]，按丁醇比為 60%或 70%計，最終丁醇濃度在12～14 g/L之間，這是現(xiàn)有工業(yè)菌種很難進一步超越的丁醇耐受性水平。因此，傳統(tǒng)ABE發(fā)酵中的低產(chǎn)物濃度已成為影響發(fā)酵經(jīng)濟性的重要因素之一。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中的丙酮和乙醇副產(chǎn)物

目前傳統(tǒng)丙酮丁醇梭菌 ABE發(fā)酵過程中，除了60%為丁醇外，同時還會有30%的丙酮和10%左右的乙醇[2]。ABE發(fā)酵的產(chǎn)物中丁醇的商業(yè)價值最高，現(xiàn)今價格維持在12 000元/t左右，副產(chǎn)物丙酮和乙醇屬于低值產(chǎn)物，價格分別在8 500元/t和5 000元/t左右。同時，所產(chǎn)生的乙酸和丁酸既無法回收，更是降低了原料的轉(zhuǎn)化效率增加了生產(chǎn)成本。因此，在無法進一步大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物濃度的情況下，提高發(fā)酵過程中作為主發(fā)酵產(chǎn)物丁醇生物合成的選擇性，減少副產(chǎn)物量來提高丁醇比例，降低糧耗不失為提升生物丁醇發(fā)酵產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟性和競爭力的有效手段。但丁醇耐受性仍是一個不可避免而必須考慮的關(guān)鍵問題。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的科研人員通過傳統(tǒng)誘變方法，盡管獲得了高丁醇比丙酮丁醇梭菌EA2018[16]，產(chǎn)物丁醇∶丙酮∶乙醇為7∶2∶1，比傳統(tǒng)菌種的丁醇比例提高10%，但從其發(fā)酵總?cè)軇舛瓤?，丁醇的濃度尚處?4 g/L左右，如要突破所述丁醇耐受性的閾值，還需作出更大的努力。

3 研究進展與應(yīng)用

中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所的研究人員從上世紀(jì)50年代起研究丙酮丁醇連續(xù)發(fā)酵制備技術(shù)，國家“七五”攻關(guān)期間通過誘變篩選獲得了高丁醇比例的 EA2018菌株，曾在河北、山東等地成功投入工業(yè)化連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用，規(guī)模達(dá)到6 000 t/年。近年來，該所中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室的楊蘊劉、姜衛(wèi)紅、楊晟研究組協(xié)作攻關(guān)，開始進行產(chǎn)溶劑梭菌的遺傳改造研究，并形成上海生物丁醇協(xié)作組。該協(xié)作組的主要技術(shù)思路是針對當(dāng)前生物丁醇制造中面臨的問題，通過產(chǎn)丁醇發(fā)酵菌株的遺傳改造以及發(fā)酵、產(chǎn)品回收工藝的優(yōu)化實現(xiàn)以下3方面目標(biāo)：1)提高產(chǎn)品中的丁醇比例；2)尋找廉價的替代原料；3)提高發(fā)酵產(chǎn)物的濃度。從而克服傳統(tǒng)發(fā)酵法制造丁醇過程中的限制性瓶頸，繼而提高生物丁醇的生產(chǎn)經(jīng)濟性。

3.1 提高丁醇比例

提高丁醇比例可以通過對微生物丁醇途徑的重構(gòu)和優(yōu)化實現(xiàn)。經(jīng)典的丁醇代謝途徑來源于產(chǎn)溶劑梭菌。產(chǎn)溶劑梭菌除生成 60%～70%的丁醇外，還有20%～30%的丙酮和10%的乙醇這2種低值副產(chǎn)物。通過對丁醇途徑的重構(gòu)和優(yōu)化有可能降低丙酮和乙醇的合成量，在保持菌株原有的較高轉(zhuǎn)化效率的基礎(chǔ)上進一步提高丁醇在總?cè)軇┲兴嫉谋壤?，增強丁醇生產(chǎn)的經(jīng)濟競爭力。

為降低副產(chǎn)物丙酮的生物合成量，Janati-Idrissi等通過傳統(tǒng)化學(xué)誘變手段，獲得了不產(chǎn)丙酮的突變株C.acetobutylicum2-BrBu1，但是丁醇比例也同時降低[17]。美國Eleftherios Terry Papoutsakis實驗室于2003年報道了利用反義 RNA技術(shù)抑制丙酮丁醇梭菌中的乙酰乙酸脫羧酶基因adc的轉(zhuǎn)錄，但丙酮濃度并未減少；接著用相同的方法抑制該菌中輔酶 A轉(zhuǎn)移酶基因ctfAB的轉(zhuǎn)錄，雖然抑制了丙酮的產(chǎn)生，但該法同時抑制了和ctfAB同處一個操縱子的乙醇脫氫酶E基因adhE的轉(zhuǎn)錄，鑒于該酶是丁醇和乙醇合成途徑的關(guān)鍵酶，因此幾乎無乙醇和丁醇的產(chǎn)生[18]；該項目組繼而在抑制ctfAB轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上回補adhE，但只提高了乙醇的產(chǎn)量，丁醇產(chǎn)量沒有提高，丁醇比例反而下降[19]；而在丟失大質(zhì)粒 pSOL的不產(chǎn)溶劑的丙酮丁醇梭菌退化菌株M5或DG1中通過過表達(dá)adhE基因重構(gòu)丁醇途徑可恢復(fù)丁醇產(chǎn)生，丁醇比例可達(dá)到90%以上，但是丁醇濃度為野生型的1/2[20-21]。

上海生物丁醇協(xié)作組蔣宇等通過敲除 EA2018菌株的丙酮合成途徑關(guān)鍵酶(乙酰乙酸脫羧酶)基因，基本阻斷了丙酮的產(chǎn)生，并經(jīng)代謝流分析與發(fā)酵優(yōu)化將丁醇的比例提高到85%以上[22]。盡管生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究業(yè)已證明，丁醇/乙醇的生物合成共用醛-醇脫氫酶，但如何進一步降低乙醇比例，成功報道甚少。這是由于無法通過基因敲除的手段阻斷乙醇產(chǎn)生而不影響丁醇生產(chǎn)。Papoutsakis實驗室通過對在M5中過表達(dá)adhE基因的重組菌的發(fā)酵優(yōu)化，使丁醇比例達(dá)到85%且濃度和野生型菌株相當(dāng)，但進一步的代謝調(diào)控效果甚微[23-24]。上海生物丁醇協(xié)作組蔣宇等正在通過代謝調(diào)控和酶特異性改造，進一步提高丁醇/乙醇比例。

3.2 拓寬生物丁醇制備中的原料源

3.2.1 薯類、菊芋等非糧原料

薯類是淀粉含量很高的農(nóng)作物，包括木薯、紅薯、馬鈴薯等，在世界各地以及我國均有大量種植。薯類原料的市場價格較玉米、小麥等糧食類原料低廉，因此已被大量用于生物乙醇的生產(chǎn)。一些生物丁醇生產(chǎn)企業(yè)也在玉米原料中混入薯類原料進行發(fā)酵，以減少玉米的用量。由于薯類原料中淀粉以外的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)等含量要明顯低于玉米，因此完全以薯類原料進行發(fā)酵的丁醇產(chǎn)量較低，需要通過培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化實現(xiàn)木薯等薯類原料對玉米的完全替代，真正實現(xiàn)生物丁醇的非糧發(fā)酵[25]。

菊芋是一種多年生草本植物，俗稱洋姜、鬼子姜。菊芋生物量極大，每公頃可產(chǎn)菊芋塊莖30～75 t。鮮菊芋塊莖中富含多聚果糖，是一種極具開發(fā)潛力的半野生資源，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學(xué)品的良好糖源。國外以菊芋為原料發(fā)酵制備丁醇的研究多有報道。Marchal等在調(diào)控pH的條件下，使得菊汁水解液發(fā)酵的總?cè)軇舛冗_(dá)到23～24 g/L[26]。大連化學(xué)物理研究所杜昱光研究員課題組提供的菊芋原料，經(jīng)上海生物丁醇協(xié)作組試驗證明，經(jīng)菊粉酶處理后的水解液能被梭菌發(fā)酵產(chǎn)生丁醇，總?cè)軇舛冉咏衩自纤?。如果能夠?qū)崿F(xiàn)原料的規(guī)模化供應(yīng)并進一步控制原料處理成本，相關(guān)研究成果具備工業(yè)化生產(chǎn)的可能。

小麥B淀粉又稱尾淀粉、淤渣淀粉、刮漿淀粉或淀粉糊精，是小麥淀粉加工以及以小麥為原料發(fā)酵酒精的副產(chǎn)物，可用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。國內(nèi)的天冠集團受讓了上海生物丁醇協(xié)作組的C.acetobutylicumEA 2018菌株，并開發(fā)了B淀粉漿和玉米的混合發(fā)酵丁醇工藝，進而實現(xiàn)了單獨以B淀粉漿為原料進行生物丁醇的生產(chǎn)。

3.2.2 木質(zhì)纖維原料

木質(zhì)纖維素被普遍認(rèn)為是一種最具應(yīng)用潛力的發(fā)酵原料。近年來，國外圍繞木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備 ABE溶劑的研究多有報道。Qureshi等采用C.beijerinckiiP260菌株測試了麥草水解液的溶劑發(fā)酵情況，在分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵2種工藝條件下，ABE產(chǎn)物濃度分別達(dá)到13.12、11.93 g/L[27]；采用分批-補料發(fā)酵工藝時，C.beijerinckiiP260菌株的丁醇生產(chǎn)強度為0.36 g/(L·h)，高于批式發(fā)酵的0.31 g/(L·h)[28]。C.beijerinckiiBA101 菌株也被用于玉米皮水解液的發(fā)酵測試，ABE溶劑濃度可達(dá)9.3 g/L[29]。相比較國外而言，國內(nèi)的相關(guān)研究較少，早期的如陳守文等利用丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumC375菌株發(fā)酵稻草酶法水解液，分別研究了氮源、生長因子、pH等因素對發(fā)酵的影響，最終的總?cè)軇舛葹?2.8 g/L，溶劑生成率為 29.9%[30]；近年來中國科學(xué)院過程研究所的李冬敏等利用汽爆秸稈膜循環(huán)酶解耦合技術(shù)進行了丙酮丁醇發(fā)酵的研究，實現(xiàn)了酶解與發(fā)酵的同步進行[31]。國內(nèi)的吉安新能源集團有限公司受讓了上海生物丁醇協(xié)作組的C.acetobutylicumEA 2018菌株，并與中國科學(xué)院過程研究所的陳洪章課題組聯(lián)合開發(fā)了秸稈半纖維素發(fā)酵丁醇技術(shù)，完成了年產(chǎn)600 t燃料丁醇的工業(yè)示范生產(chǎn)線(http://www.ipe.cas.cn/xwdt/ttxw/200910/t20091022_2586814.html)。

綜合目前的研究進展來看，木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化制造丁醇的工藝路線可以概括為：原料預(yù)處理和水解為單糖；糖液發(fā)酵生成丁醇；產(chǎn)物蒸餾回收等。盡管上述工藝路線具備可行性，但仍有諸多技術(shù)瓶頸需要克服。僅就菌種而言，纖維水解液中五碳糖和六碳糖的同等利用是迫切需要解決的難點之一。

1)五碳糖代謝

木質(zhì)纖維原料中的六碳糖主要是葡萄糖(纖維素的主要組分)，五碳糖主要是木糖以及阿拉伯糖(半纖維素的主要組分)[32]。其中，葡萄糖是最主要成分，其次為木糖，阿拉伯糖的含量較少。產(chǎn)溶劑梭菌(C.acetobutylicum，C.beijerinckii)具備天然的木糖利用能力，但與葡萄糖相比，木糖代謝能力不足，具體表現(xiàn)為在以木糖為唯一碳源發(fā)酵時，溶劑得率和生成速率低[33]。鑒于木糖是木質(zhì)纖維原料中含量僅次于葡萄糖的最主要五碳糖，因此，開展產(chǎn)溶劑梭菌的木糖代謝工程研究具有重要意義。

對于大多數(shù)細(xì)菌來說，木糖被轉(zhuǎn)運入細(xì)胞后首先通過木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶兩步催化反應(yīng)生成5-磷酸木酮糖，隨后進入磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway，PPP)，過程中涉及4個關(guān)鍵酶：轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5-磷酸-核糖異構(gòu)酶以及 5-磷酸-核酮糖差向異構(gòu)酶，最后以產(chǎn)物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛進入糖酵解途徑。Cynkin等研究者早先提出在梭菌中木糖也經(jīng)由這條途徑代謝[34-35]，但限于基因組信息以及遺傳操作手段的匱乏，在分子水平上對該途徑上關(guān)鍵酶基因的解析工作一直未見報道，因而也就無法給菌株的木糖代謝工程改造提供相關(guān)信息。隨著近年來丙酮丁醇梭菌模式菌株C.acetobutylicumATCC 824全基因組信息的公布[36]，以及產(chǎn)溶劑梭菌遺傳操作技術(shù)上的突破[37-38]，上述木糖途徑解析的研究工作也迎來了契機。上海生物丁醇協(xié)作組顧陽等通過比較基因組學(xué)以及分子生物學(xué)實驗鑒定了C.acetobutylicumATCC 824木糖代謝途徑中的木糖異構(gòu)酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB[39]，并通過在C.acetobutylicumATCC 824中過量表達(dá)E.coli來源的轉(zhuǎn)醛酶基因A(talA)，提高了該菌株的木糖利用率，從而證明了在丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum中轉(zhuǎn)醛酶是PPP途徑的限速酶之一[40]。由此可見，采用代謝工程實驗方法增強產(chǎn)溶劑梭菌中木糖代謝通量是提高其木糖利用能力的有效手段。

2)葡萄糖阻遏效應(yīng)(Carbon catabolite repression，CCR)的解除

微生物在利用復(fù)雜碳源過程中普遍存在CCR效應(yīng)[41]，即速效碳源的快速利用對非速效碳源的代謝產(chǎn)生抑制作用。這一現(xiàn)象在產(chǎn)溶劑梭菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液過程中同樣存在[42]。換言之，水解液中同時存在的葡萄糖抑制了細(xì)胞對其他糖源(木糖、阿拉伯糖等五碳糖)的有效利用，降低了物料轉(zhuǎn)化效率和發(fā)酵的經(jīng)濟性。因此，解除產(chǎn)溶劑梭菌中的CCR效應(yīng)、實現(xiàn)其對五碳糖和六碳糖的同等利用是木質(zhì)纖維素制備生物丁醇中的一個關(guān)鍵科學(xué)問題。

在革蘭氏陽性菌模式菌株枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis中的已有研究表明，CCR效應(yīng)的發(fā)生是由多效調(diào)控因子 CcpA介導(dǎo)的[43]。作為重要的工業(yè)菌種，有關(guān)產(chǎn)溶劑梭菌CCR效應(yīng)的相關(guān)機理性研究極少，其中是否也存在與B.subtilis中相似的CcpA調(diào)控元件以及CCR效應(yīng)的作用模式，這些問題都有待深入研究。2001年丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC 824全基因組序列的公布為上述研究提供了信息平臺[36]。英國Heriot-Watt大學(xué)的Mitchell教授等2003年通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了C.acetobutylicumATCC 824中存在參與CCR效應(yīng)的調(diào)控元件 CcpA[44]。本協(xié)作組的任聰?shù)葘.acetobutylicumATCC 824中的CcpA蛋白作了鑒定，并證明該蛋白確實與CCR效應(yīng)相關(guān)[45]。同時，通過敲除 ATCC 824中的ccpA基因，菌株固有的CCR效應(yīng)得以解除，實現(xiàn)了對葡萄糖-木糖混合碳源的同等利用[45]。上述研究結(jié)果為通過代謝工程手段構(gòu)建適用于木質(zhì)纖維水解液混糖發(fā)酵的工程菌株提供了新思路。上海生物丁醇協(xié)作組現(xiàn)在已經(jīng)獲得一株能耐受玉米秸稈蒸汽爆破酶解糖液中的抑制物，并能同時利用其中葡萄糖和木糖高產(chǎn)丁醇的菌株(結(jié)果未發(fā)表)。

3.2.3 合成氣

合成氣主要是由CO、H2、CO2組成的混合氣體，來源廣泛，包括煤、油頁巖、焦油沙、重殘渣、劣質(zhì)天然氣以及生物質(zhì)。以合成氣為原料合成氨、含氧化合物和烴類等化工原料的生產(chǎn)技術(shù)已投入商業(yè)運行。近年來，以生物技術(shù)主導(dǎo)的合成氣綜合利用技術(shù)引起廣泛關(guān)注，尤其是通過厭氧發(fā)酵方法將合成氣轉(zhuǎn)化成各種有用的燃料和化學(xué)品已成為新的研究熱點[46]。

能夠利用合成氣的微生物都是厭氧菌，其可分為兩種類型，一種以C1化合物(CO或CO2)作為碳源，而以氫作為能源；另一種同時利用C1化合物作為碳源和能源。大多數(shù)能夠利用合成氣的微生物的主要產(chǎn)物為乙酸、乙醇和H2[46]，其中，微生物利用合成氣厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是迄今為止唯一成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)。Clostridium ljungdahlii是目前合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇最具潛力的菌株。Phillips等[47]通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化，使得該菌株乙醇發(fā)酵的產(chǎn)物濃度上升到23 g/L。此外，Clostridium carboxidivoransP7對合成氣的利用能力也受到廣泛關(guān)注，該菌株發(fā)酵合成氣產(chǎn)生的乙醇濃度可達(dá)10 g/L[48]。

目前已知的可利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物菌株僅有Clostridium carboxidivoransP7(DSM15243)和Butyribacterium methylotrophicum(DSM3468)，丁醇產(chǎn)量分別為1.776 g/L和2.7 g/L[49]。實現(xiàn)微生物利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的可行技術(shù)路線主要包括：1)在Clostridium ljungdahlii等乙醇生產(chǎn)菌株中引入乙醇到丁醇的代謝途徑；2)對天然的可利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的微生物進行代謝工程改造，提高丁醇的生產(chǎn)強度；3)在傳統(tǒng)的利用糖源的丁醇生產(chǎn)菌株中導(dǎo)入合成氣代謝途徑。上海生物丁醇協(xié)作組肖晗等已初步建立了合成氣丁醇產(chǎn)生菌的遺傳操作系統(tǒng)，正在嘗試進行基因工程改造。

3.3 提高ABE發(fā)酵液中的丁醇濃度

3.3.1 低溫發(fā)酵和產(chǎn)物氣提回收技術(shù)

丁醇對菌體細(xì)胞具有較大毒性，通過菌株遺傳改造增強其丁醇耐受性僅為提高丁醇生物合成的選擇性和產(chǎn)物濃度創(chuàng)造了有利條件。為降低發(fā)酵產(chǎn)物丁醇對生產(chǎn)菌種的抑制作用，尚可通過發(fā)酵和下游工藝的改進來減輕發(fā)酵液中的丁醇毒性，進而提高發(fā)酵終點的丁醇濃度。Glassner等采用發(fā)酵溫度調(diào)控的方法來提高丁醇產(chǎn)物濃度，取得良好的效果[50]，在產(chǎn)溶劑階段的發(fā)酵溫度由37℃下調(diào)至30℃甚至更低，產(chǎn)物丁醇濃度可以達(dá)到16.5 g/L以上。本協(xié)作組劉旭東等通過變溫發(fā)酵實現(xiàn)溶劑產(chǎn)量的大幅提高，丙酮丁醇梭菌 EA2018的玉米單批發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量可達(dá)28.0 g/L，其中丁醇20.1 g/L、乙醇3.4 g/L、丙酮4.5 g/L(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。不過，采用溫控技術(shù)實現(xiàn)丁醇高產(chǎn)過程中，由于溫度降低使得梭菌細(xì)胞代謝減緩，因此發(fā)酵周期會延長，細(xì)胞生產(chǎn)強度會降低；此外，降溫操作從工業(yè)應(yīng)用角度來說要增加能耗，并增大設(shè)備的前期投資，因此，要綜合考慮丁醇產(chǎn)量提高和生產(chǎn)運行成本之間的經(jīng)濟平衡。

采用發(fā)酵-產(chǎn)物氣提法回收(Gas-stripping)耦合技術(shù)也是降低溶劑毒性的有效方法[51-53]。該方法利用發(fā)酵產(chǎn)生的氣體(H2、CO2)或者外界通入惰性氣體來捕捉發(fā)酵產(chǎn)物，降低發(fā)酵液中的溶劑量，收集到的溶劑傳送至冷凝裝置回收，而氣體可以回流到發(fā)酵體系中繼續(xù)回收發(fā)酵產(chǎn)物。同一協(xié)作組的陳軍等通過C.acetobutylicumEA 2018批式玉米醪發(fā)酵-氣提耦合技術(shù)將 ABE發(fā)酵產(chǎn)物的濃度提高至30 g/L，其中丁醇20 g/L(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

3.3.2 在高耐丁醇菌株中構(gòu)建異源丁醇途徑

傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵中產(chǎn)物濃度的提高主要受制于菌株丁醇耐受性差。主要的產(chǎn)溶劑梭菌C.acetobutylicum的丁醇耐受極限低于2%(V/V)[54]。從菌體細(xì)胞對丁醇耐受性的研究結(jié)果來看，該表型是由多基因決定的，并且擁有十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[55]，這使得對目前菌株的丁醇耐受性改造存在一定的困難。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，某些菌株如Lactobacillus brevis、Lactobacillus delbrueckii[56]具有明顯高于目前的產(chǎn)溶劑梭菌的丁醇耐受性，表明高丁醇耐受性的菌株在自然界中是存在的。協(xié)作組的李鍵等通過馴化及篩選等策略獲得 2株丁醇耐受菌株，經(jīng)鑒定均屬于乳酸桿菌屬Lactobacillus。在此基礎(chǔ)上，通過對一個乳酸菌庫的丁醇耐受性檢測，發(fā)現(xiàn)其中大部分菌株具有明顯高于產(chǎn)溶劑梭菌的丁醇耐受性，暗示了乳酸桿菌屬作為一個整體，可能具有較高丁醇耐受性。同時，獲得的數(shù)株丁醇耐受極限高于 3%(V/V)的菌株，有潛力成為構(gòu)建丁醇途徑的宿主菌。

丁醇合成途徑已被成功導(dǎo)入Escherichia coli[57-58]、Saccharomyces cerevisiae[59]、Pseudomonas putida[60]和Bacillus subtilis[60]、Lactobacillus brevis[61]中，并用于丁醇生物合成的研究，所有上述菌株發(fā)酵后都能夠獲得微量的丁醇，證明由非自然宿主生產(chǎn)丁醇是可行的。當(dāng)然，異源丁醇合成也存在諸多困難，如：酶蛋白編碼基因的合理選擇，基因的有效表達(dá)，代謝中間產(chǎn)物的平衡以及完全敲除競爭性途徑等，未來仍然需要合成生物學(xué)、代謝工程、蛋白質(zhì)工程等手段來提高丁醇的產(chǎn)物濃度。

4 展望

丁醇作為一種重要的化學(xué)品和新一代的生物燃料，其生物法制備方法已逐漸成為世界范圍內(nèi)的研究熱點。當(dāng)前迫切需要解決的是進一步降低生物丁醇的制造成本，以獲得相對于石化合成路線的市場競爭優(yōu)勢。

根據(jù)我國農(nóng)產(chǎn)品種植結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)ABE發(fā)酵中最常用的底物主要是玉米、薯干、谷物等淀粉質(zhì)原料，這些農(nóng)產(chǎn)品一定程度上可作為日?？诩Z，也用作禽畜飼料和工業(yè)用糧。考慮到國家的糧食安全問題，生物丁醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的出路在于非糧類底物的高效利用以及木質(zhì)纖維素用于溶劑發(fā)酵并達(dá)到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的水平。在纖維丁醇生產(chǎn)工藝處于尚難產(chǎn)業(yè)化，有待完善的條件下，以木薯、菊芋等非糧作物替代玉米進行溶劑發(fā)酵也是一條可供選擇的措施。但是隨著人們對木質(zhì)纖維素水解研究的深入和纖維素酶成本的下降，此類可再生資源用于丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)將成為必然的發(fā)展趨勢。

為增強丁醇發(fā)酵的經(jīng)濟競爭力，除了采用廉價原料及其相適應(yīng)的生產(chǎn)菌外，不論是提高發(fā)酵的丁醇濃度(Concentration)、底物轉(zhuǎn)化效率(Yield)還是生產(chǎn)強度(Productivity)，培育和構(gòu)建新型生產(chǎn)菌種至關(guān)重要，而基因工程和代謝工程等近代分子生物學(xué)技術(shù)為此目標(biāo)的實現(xiàn)提供了可能性。

致謝：江南大學(xué)的孫志浩教授和倪曄副教授為本文提供了數(shù)據(jù)支持，在此表示感謝。

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Current status and prospects of biobutanol manufacturing technology

Yang Gu1, Yu Jiang1,2, Hui Wu1, Xudong Liu1, Zhilin Li1, Jian Li1, Han Xiao1, Zhaobing Shen2,Jingbo Zhao1, Yunliu Yang1, Weihong Jiang1,2, and Sheng Yang1,2
1 Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China 2 Shanghai Research and Development Center of Industrial Biotechnology, Shanghai 201201, China

Received:May 14, 2010;Accepted:June 23, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2007CB707803), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA05Z407), Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences(No.KSCX2-YW-G-075),Planned Scientific Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality(No.08dz1207100).

Corresponding author:Weihong Jiang.Tel: +86-21-54924172; Fax: +86-21-54924015; E-mail: whjiang@sibs.ac.cn Sheng Yang.Tel: +86-21-54924173; Fax: +86-21-54924015; E-mail: syang@sibs.ac.cn國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2007CB707803)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2007AA05Z407)，中科院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(No.KSCX2-YW-G-075)，上海市科委科研計劃項目(No.08dz1207100)資助。