精清去除方法對(duì)嶗山奶山羊精液冷凍保存效果的影響

程 明 ，李建棟 ，趙金山 ，汪文鑫 ，江 科 ，戈 新

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109）

隨著規(guī)模化養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，精液保存逐漸成為制約羊人工授精技術(shù)推廣及良種推廣的技術(shù)瓶頸。目前，生產(chǎn)中仍以現(xiàn)采現(xiàn)用或常溫短期保存為主，超低溫保存仍處于研究階段。嶗山奶山羊是我國(guó)的優(yōu)良地方品種，2002年曾作為日生禮物由朱基總理代表中國(guó)政府贈(zèng)送給泰國(guó)王后。近年來(lái)，隨著青島都市化進(jìn)程的不斷加快，嶗山奶山羊也逐漸向規(guī)?；犸暟l(fā)展，否則將面臨滅絕的危險(xiǎn)，精液冷凍作為繁殖手段和保種手段顯得非常重要。目前有關(guān)山羊精液冷凍保存的研究中仍主要使用含卵黃的稀釋液[1-3]，而是否去除精清和去除方法各有不同[1-5]。關(guān)于嶗山奶山羊的精液冷凍保存尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)幾種去除精清的方法進(jìn)行了比較研究，以期獲得好的精液保存效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 嶗山奶山羊公羊，1.5～2歲，身體健康，膘情適中，性欲旺盛。所有試驗(yàn)羊均來(lái)自青島嶗山奶山羊原種場(chǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理。

1.1.2 試驗(yàn)器材與試劑 主要儀器設(shè)備：倒置生物顯微鏡、數(shù)顯低溫溫度計(jì)、恒溫操作臺(tái)、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、液氮容器、假陰道及集精杯。

主要試劑藥品：葡萄糖、乳糖、檸檬酸鈉、青霉素、鏈霉素、75%酒精、醫(yī)用凡士林、新潔爾滅和高錳酸鉀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備 選擇身體健康、性欲旺盛的公羊，提前1～2月加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)，提高日糧中維生素和蛋白質(zhì)水平，提前2～3周訓(xùn)練采精并檢查精液質(zhì)量。采精前刷拭羊體，尤其是待采精公羊腹部和臺(tái)羊后軀，用消毒液沖洗公羊包皮。

1.2.2 器材的準(zhǔn)備 所有器材提前一天洗刷、晾干，提前半天消毒備用。采精前將假陰道與集精杯裝好，假陰道內(nèi)前1/3部分涂以滅菌醫(yī)用凡士林，用生理鹽水沖洗內(nèi)胎，自注水孔裝入適量37～45℃溫水，打氣，用滅菌紗布包住兩端，置于恒溫箱中備用。

1.2.3 溶液的配制 基礎(chǔ)液：100mL水+3.4gTriss+1.9g檸檬酸+0.55 g葡萄糖。I液：8.2 mL基礎(chǔ)液+1.8 mL卵黃。II液：9.4 mL I液+0.6 mL甘油。Ringer液：0.85%氯化鈉+0.033%氯化鈣+0.03%氯化鉀+0.2%葡萄糖。

1.2.4 采精與精液品質(zhì)檢查

（1）以發(fā)情母羊作臺(tái)羊（訓(xùn)練有素的公羊也可以用公羊作臺(tái)羊）。將公羊刷拭，然后牽入采精室準(zhǔn)備采精。正式采精前讓其空爬幾次，以提高采精量與精子質(zhì)量。常規(guī)采精。

（2）取下集精杯置于32℃水浴中，記錄精液顏色、氣味、云霧狀及采精量。顏色、氣味異常的精液不要。

（3）精子密度估算。取一小滴精液于潔凈載玻片上，加蓋蓋玻片，顯微鏡下400～600倍觀(guān)察。視野中精子間空隙很小，看不清單個(gè)精子的運(yùn)動(dòng)，記為密，精子數(shù)在10億以上/mL；間隙明顯，彼此間距離約為一個(gè)精子長(zhǎng)度，有些精子的活動(dòng)可以清楚的看到，記為中，精子數(shù)在2～10億；精子分散存在，間隙超過(guò)一個(gè)精子的長(zhǎng)度，記為稀，精子數(shù)在2億以下。

（4）活力估測(cè)。滴一滴稀釋精液于載玻片上，250～400倍鏡下觀(guān)察，直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)在總精子數(shù)中所占的比率即為活力。

（5）準(zhǔn)確精子計(jì)數(shù)。原精液用3%鹽水稀釋?zhuān)谘蛴?jì)數(shù)板上鏡下數(shù)精子數(shù)，按公式求得精子密度。

1.2.5 精液處理

（1）離心去精清。取精液于離心管中，加入5～10倍體積的稀釋液，輕輕混勻，配平，置于離心機(jī)中離心，離心結(jié)束后棄去上清。重復(fù)1～2次。

（2）稀釋與降溫。用配好的稀釋液按比例稀釋?zhuān)眉啿及笾糜诒渲屑s2 h降至4℃，用Ⅱ液按比例稀釋?zhuān)b管，平衡30 min。

（3）冷凍。在泡沫盒里加入1/3以上的液氮，鋁飯盒漂浮其上（飯盒表面溫度約-130℃），將平衡好的細(xì)管置于飯盒管上，約5 min后完全浸入液氮中。

（4）解凍檢查。隨機(jī)挑選2～3支精液于37℃溫水中解凍，剪去細(xì)管頭，滴少量精液于載玻片上，鏡檢精子活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS12.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 幾種洗滌液對(duì)精子活力的影響

分別以生理鹽水、稀釋液基礎(chǔ)液和Ringer液作為洗滌液，按上述方法處理精液，完成冷凍并檢查解凍后的精子活力。離心采用1 000 r/min，8 min。

表1 在不同洗滌液液組的精子活力

2.2 離心轉(zhuǎn)速對(duì)離心效果及精子活力的影響

用基礎(chǔ)液作洗滌液，分別采用500 r/min、1 000 r/min、1 500 r/min、2 000 r/min，離心 10 min，按上述的方法處理精液，比較試驗(yàn)結(jié)果。

表2 在不同離心轉(zhuǎn)速下的精子活力變化

2.3 離心時(shí)間對(duì)離心效果及精子活力的影響

用基礎(chǔ)液作洗滌液，采用1 000 r/min，分別離心5 min、10 min、15 min、20 min，按上述的方法處理精液，比較試驗(yàn)結(jié)果。

表3 不同離心時(shí)間的精子活力變化

2.4 洗滌次數(shù)對(duì)精子活力的影響

以基礎(chǔ)液作洗滌液，采用1 000 r/min，10 min離心，分別洗滌1次、2次、3次、4次，按上述的方法處理精液，比較試驗(yàn)結(jié)果。

表4 不同洗滌次數(shù)對(duì)精子活力的影響

3 討論

精清成分非常適合精子生存，對(duì)精子起營(yíng)養(yǎng)和支持作用。但有研究認(rèn)為精漿中同時(shí)存在著許多尚未被人類(lèi)所了解清楚的蛋白質(zhì)成分。在多種動(dòng)物的精漿中已發(fā)現(xiàn)許多抗生育因子，如去能因子、人類(lèi)抗生育因子、兔頂體穩(wěn)定因子、牛精漿素和山羊卵黃凝結(jié)酶等，這些因素通過(guò)抑制精子的獲能、頂體反應(yīng)的發(fā)生、誘導(dǎo)頂體酶的提前釋放等機(jī)制影響精子活力[4]。多數(shù)研究認(rèn)為山羊精液冷凍保存需要進(jìn)行去精清處理[1，4，6]，主要是精清中的磷脂酶或類(lèi)磷脂酶等物質(zhì)對(duì)精子，尤其對(duì)冷凍后精子的品質(zhì)十分不利。目前關(guān)于嶗山奶山羊精液冷凍保存的研究還沒(méi)有報(bào)道，本研究通過(guò)去精清處理過(guò)程中幾個(gè)方案的比較，獲得了一套精液保存效果理想的處理方案。

通過(guò)幾種洗滌液的比較研究發(fā)現(xiàn)，使用稀釋液的基礎(chǔ)液組效果最好，Ringer液組效果最差，差異顯著。分析原因認(rèn)為，這種方案對(duì)液體成分改變最小，不會(huì)在洗滌、稀釋等程序中多次改變液體成分，使精子一直在相對(duì)穩(wěn)定的液體環(huán)境中，免受反復(fù)沖擊，有利于精子活力的保持。

而在離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速的研究中發(fā)現(xiàn)，最佳的組合是1 000 r/min，離心10 min，速度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短不能使精子與精清分離，達(dá)不到離心的目的；速度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)雖然離心徹底，但是會(huì)使精子因相互擠壓而造成損傷，影響精子活力。離心時(shí)間超過(guò)20 min，轉(zhuǎn)速超過(guò)2 000 r/min，會(huì)對(duì)精子活力造成較大影響，與最佳組合相比差異顯著。

在洗滌次數(shù)的比較中發(fā)現(xiàn)，隨著洗滌次數(shù)的增加精子活力不斷下降，離心和反復(fù)稀釋都會(huì)對(duì)精子造成傷害，但相鄰的兩組之間沒(méi)有顯著差異；而離心1次的解凍活力不如2次好，分析結(jié)果應(yīng)還與每一次的稀釋倍數(shù)有關(guān)，在高倍稀釋的情況下一次離心可能也會(huì)達(dá)到較好的效果。在本研究中采用2次洗滌，每次5倍稀釋效果最好。

去精清處理一方面要盡量去除干凈，另一方面要盡量減少對(duì)精子造成的損傷，保持精子活力。通過(guò)幾個(gè)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在盡可能大倍數(shù)稀釋的情況下選擇適當(dāng)?shù)碾x心轉(zhuǎn)速和時(shí)間非常重要，液體成分也不要反復(fù)改變，這樣有利于精子活力的保持。在本研究中采用稀釋液的基礎(chǔ)液做洗滌液，1 000 r/min，離心2次，每次10 min，效果最好，解凍活力達(dá)0.55，是一套成功的方案。

[1] 張建軍，史兆國(guó)，楊軍祥，等.波爾山羊除精漿冷凍精液的試驗(yàn)研究[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2008，28（1）:25，26.

[2] 楊素芳，鄒知明，黎江山，等.山羊精液冷凍保存技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（11）：4532-4533，453.

[3] 徐振軍，趙冰，魏丹，等.絨山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2009，45（1）:16-18.

[4] 楊軍祥.除去精漿對(duì)波爾山羊冷凍精液品質(zhì)的影響[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2009，29（2）:22-24.

[5] 劉興偉，李靜，宋先忱，等.精液處理方法對(duì)遼寧絨山羊凍精質(zhì)量的影響[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2007，15:39，40.