曲云淼,董振國(guó)
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豬的克隆和轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)為胚胎工程、品種改良以及醫(yī)學(xué)組織工程都提供了新的思路,在諸如異體器官移植和生產(chǎn)一些特定的蛋白質(zhì)等方面具有廣闊的前景。而豬的克隆和轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)等都需要大量成熟的、具有發(fā)育潛力的卵母細(xì)胞[1]。但是由于豬卵母細(xì)胞的生理生化特異性,給克隆和轉(zhuǎn)基因研究帶來(lái)諸多不利因素。因此,需要找到一種理想的豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素有許多,如所處性周期階段、生長(zhǎng)因子的作用等。本實(shí)驗(yàn)主要探討了培養(yǎng)時(shí)間,以及在培養(yǎng)基中添加表皮生長(zhǎng)因子對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。
在屠宰場(chǎng)將被屠宰的豬卵巢立即取下,用生理鹽水沖洗干凈,保存于25~35℃含有青霉素(100IU/mL)和鏈霉素(100 IU/mL)的生理鹽水的保溫瓶中,在3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水配制的70%酒精浸泡1 min,然后再用預(yù)熱的生理鹽水洗滌卵巢至無(wú)血水為止,選擇排卵點(diǎn)多且直徑在2~5 mm卵泡的卵巢,帶進(jìn)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室。
使用配有12號(hào)針頭的10 mL注射器從2~5 mm卵泡中抽吸卵母細(xì)胞,采卵液為T(mén)CM-199(Hank's),成熟液為自配成熟液,成份為:TCM-199(Earle's)培養(yǎng)液+0.1%PVA(聚乙烯醇)+3.05 mmol/LD-葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸鈉+75 mg/mL青霉素+50 mg/mL硫酸鏈霉素,在每次使用之前加入藥品:0.57 mmol/L半胱氨酸,0.5 IU/mL LH,0.5 IU/mL FSH,10μg/mL EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。將成熟液在培養(yǎng)皿中作成50 μL的微滴,將卵母細(xì)胞放入成熟滴在5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。
在自配成熟液作為對(duì)照組,分別添加10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL EGF 的成熟液培養(yǎng)COCs(卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體),放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后,觀察卵母細(xì)胞成熟率。
表1 EGF濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響
由表1可以看出,添加EGF各組與對(duì)照組相比,成熟率都顯著提高,差異顯著。添加EGF各組的成熟率隨著EGF添加濃度的增加也不斷上升。
將采集到的可用卵母細(xì)胞放入5%CO2、38.5℃、飽和濕度的相同培養(yǎng)條件下分別進(jìn)行體外成熟培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間分別為36 h、40 h、44 h和48 h,觀察卵母細(xì)胞成熟率。
由表2可以看出,隨著成熟時(shí)間的增長(zhǎng),成熟率逐漸增加。
表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響
EGF是一種活性物質(zhì),由53個(gè)氨基組成,通過(guò)與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類(lèi)物質(zhì)[1]。Carpenter等報(bào)道,它對(duì)不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)都具有很強(qiáng)的促分裂作用。EGF不但能促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂,也間接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞胞漿的成熟。EGF可以促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)張、減少縫隙連接,抑制顆粒細(xì)胞合成卵母細(xì)胞成熟抑制物(OMI)的作用,促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[2],也可以參與并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞外大分子的生物合成。EGF通過(guò)與細(xì)胞膜上的EGF受體(EGFR)結(jié)合,啟動(dòng)、催化、維持與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有關(guān)的一系列生化過(guò)程。EGF的作用機(jī)理可能是與釋放成熟刺激信號(hào)阻斷了卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞的聯(lián)系有關(guān),也可能其直接對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所有添加EGF試驗(yàn)組的成熟率隨著添加量的增加而不斷上升,并且均要高于未添加EGF的試驗(yàn)組,差異顯著。
由于動(dòng)物的種屬差異和個(gè)體差異,其體外培養(yǎng)的時(shí)間上也是有所差異的。即使同種動(dòng)物在相同的成熟培養(yǎng)條件下其培養(yǎng)時(shí)間也是有所不同的[3]。目前,牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間在20~30 h,而豬卵母細(xì)胞比較特殊,通常需要48 h左右才能達(dá)到核成熟,在24 h的核成熟率幾乎為零。Yoshida認(rèn)為豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間不能低于30 h。30 h之前成熟率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而迅速上升,30 h后成熟率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而緩慢上升。豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)36 h和42 h的成熟率無(wú)顯著差異,但顯著低于46 h的成熟率。Sosnowki等對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)成熟率越高,且48 h與36 h之間差異顯著[4]。殷駿等研究了體外培養(yǎng)32~56 h對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),第一極體排出率也逐漸增高,但老化率也相應(yīng)增長(zhǎng)。文國(guó)藝等也指出,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間固然可以提高卵母細(xì)胞成熟率,但豬的卵母細(xì)胞也會(huì)逐漸老化。世界首例轉(zhuǎn)基因克隆豬的成熟培養(yǎng)時(shí)間為42~44 h。因此在保證一定的核成熟率的前提下,可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件縮短豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,體外培養(yǎng)48 h卵母細(xì)胞的成熟率最高,但與44 h試驗(yàn)組差異不顯著。因此我們可以將44作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)時(shí)間。
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